论文部分内容阅读
石刁柏(Asparagus officinalis)又名芦笋，为百合科天门冬属多年生雌雄异株草本植物，是研究植物性别决定机制的模式材料之一。目前对石刁柏已经进行了全基因组测序，在分子水平对其性别决定机制有了一定的了解。但是，在细胞学上对石刁柏的研究仍然存在较多的限制性因素，如仍未获得准确的染色体核型、同型性染色体XY在细胞学水平上仍无法区分、Y染色体雄性特异区无法在染色体上标定等，这些问题都极大限制了对石刁柏性染色体起源及演化机制研究。其次，单拷贝基因染色体FISH技术在染色体研究中具有重要的作用，但是植物基因组中较高的重复序列含量也给该技术的应用增加了难度。因此，为了从细胞学水平建立准确的石刁柏染色体核型及稳定的XY性染色体细胞学标记，本文利用生物信息学技术对石刁柏基因组中单拷贝基因进行分析与注释，同时在对单拷贝基因染色体FISH技术关键环节优化的基础上，建立石刁柏单拷贝基因染色体FISH技术，并对每条染色体上的单拷贝基因进行了细胞学定位。主要研究结果如下：
1.为了获得单染色体细胞学标记探针，利用生物信息学技术对石刁柏全基因组单拷贝基因进行了注释。结果表明，石刁柏基因组中共筛选到72个单拷贝基因，占石刁柏基因总数的0.224%，其序列总长为382,766bp，占整个基因组的0.032％。从单拷贝基因在染色体上的分布来看，每条染色体上单拷贝基因数量在2-12个之间，其中2号染色体上最多，为12个，8号染色体单拷贝基因最少，仅为2个。另外，对单拷贝基因在每条染色体上分布位置分析表明，单拷贝基因在染色体上多分布在染色体端部，说明其分布不是随机的，存在一些热点区域。
2.为了获得稳定重复性高的单拷贝基因FISH信号，我们对基因组封阻DNA与探针的比例、分段混合探针、探针的稳定性3个方面对单拷贝基因FISH技术体系进行了优化。结果表明，本研究中封阻基因组DNA与探针的比例为1:4时能够有效屏蔽背景信号；将5kb以上的大片段分成1~2kb的片段分段进行探针标记，混合探针比单片段探针杂交结果产生的信号更加清晰稳定且重复性更高；我们利用长度分别为10000bp、8021bp、6386bp的Ao1-2及其两端无重复的序列、Ao5-1、Ao-3-8进行探针标记，杂交结果显示，探针信号的亮度与探针长度成正相关，同时利用5号染色体上3个不同位置的基因Ao1-2、Ao1-4、Ao1-6进行双色探针标记，杂交结果显示，杂交信号所在位置与物理图谱位置一致，由此可知本研究所建立的石刁柏单拷贝基因FISH技术具有较高的稳定性和可重复性。
3.为了建立准确的核型分析，我们利用单拷贝基因开发了石刁柏单染色体成套细胞学标记。结果表明，利用中期染色体FISH技术我们在石刁柏每条染色体上都获得了清晰稳定的细胞学标记；减数分粗线期、终变期及中期1的结果表明，单拷贝基因均能在相应的染色体上杂交出背景较少、信号明亮、重复性高的杂交信号。在每对染色体上均找到了稳定了遗传学标记，我们可以在细胞学上对每对染色体进行区别，建立了准确的石刁柏核型。
4.为了对石刁柏Y染色体上MSY区域进行染色体定位，我们从MSY区域的13个单拷贝基因序列中筛选出MSY-2、MSY-5、MSY-9、MSY-10、MSY-12共5个单拷贝序列并进行了染色体荧光原位杂交。结果表明，在雄株细胞核中仅发现一个信号，在雌株中未发现信号；从位置上来看，所获得的杂交信号在Y染色体短臂末端，这和MSY物理图谱位置是一致的。同时，我们对雄花减数分裂染色体的杂交结果也表明在粗线期也存在稳定清晰的一个杂交信号。由此可见，我们可以在细胞学上找到稳定的Y染色体MSY区域的细胞学标记，能够有效区分同型性染色体XY，且能对Y染色体上的MSY位置进行标定。
5.利用本研究所建立的技术体系，我们对石刁柏基因组组装中未能组装上的Scaffold和6号染色体上基因Ao3-4的3个拷贝进行了组装质量验证，结果发现该基因仅在6号染色体上存在一个杂交信号，说明Scaffold上的两个拷贝为错误组装，进一步修正了基因组组装结果。
1.为了获得单染色体细胞学标记探针，利用生物信息学技术对石刁柏全基因组单拷贝基因进行了注释。结果表明，石刁柏基因组中共筛选到72个单拷贝基因，占石刁柏基因总数的0.224%，其序列总长为382,766bp，占整个基因组的0.032％。从单拷贝基因在染色体上的分布来看，每条染色体上单拷贝基因数量在2-12个之间，其中2号染色体上最多，为12个，8号染色体单拷贝基因最少，仅为2个。另外，对单拷贝基因在每条染色体上分布位置分析表明，单拷贝基因在染色体上多分布在染色体端部，说明其分布不是随机的，存在一些热点区域。
2.为了获得稳定重复性高的单拷贝基因FISH信号，我们对基因组封阻DNA与探针的比例、分段混合探针、探针的稳定性3个方面对单拷贝基因FISH技术体系进行了优化。结果表明，本研究中封阻基因组DNA与探针的比例为1:4时能够有效屏蔽背景信号；将5kb以上的大片段分成1~2kb的片段分段进行探针标记，混合探针比单片段探针杂交结果产生的信号更加清晰稳定且重复性更高；我们利用长度分别为10000bp、8021bp、6386bp的Ao1-2及其两端无重复的序列、Ao5-1、Ao-3-8进行探针标记，杂交结果显示，探针信号的亮度与探针长度成正相关，同时利用5号染色体上3个不同位置的基因Ao1-2、Ao1-4、Ao1-6进行双色探针标记，杂交结果显示，杂交信号所在位置与物理图谱位置一致，由此可知本研究所建立的石刁柏单拷贝基因FISH技术具有较高的稳定性和可重复性。
3.为了建立准确的核型分析，我们利用单拷贝基因开发了石刁柏单染色体成套细胞学标记。结果表明，利用中期染色体FISH技术我们在石刁柏每条染色体上都获得了清晰稳定的细胞学标记；减数分粗线期、终变期及中期1的结果表明，单拷贝基因均能在相应的染色体上杂交出背景较少、信号明亮、重复性高的杂交信号。在每对染色体上均找到了稳定了遗传学标记，我们可以在细胞学上对每对染色体进行区别，建立了准确的石刁柏核型。
4.为了对石刁柏Y染色体上MSY区域进行染色体定位，我们从MSY区域的13个单拷贝基因序列中筛选出MSY-2、MSY-5、MSY-9、MSY-10、MSY-12共5个单拷贝序列并进行了染色体荧光原位杂交。结果表明，在雄株细胞核中仅发现一个信号，在雌株中未发现信号；从位置上来看，所获得的杂交信号在Y染色体短臂末端，这和MSY物理图谱位置是一致的。同时，我们对雄花减数分裂染色体的杂交结果也表明在粗线期也存在稳定清晰的一个杂交信号。由此可见，我们可以在细胞学上找到稳定的Y染色体MSY区域的细胞学标记，能够有效区分同型性染色体XY，且能对Y染色体上的MSY位置进行标定。
5.利用本研究所建立的技术体系，我们对石刁柏基因组组装中未能组装上的Scaffold和6号染色体上基因Ao3-4的3个拷贝进行了组装质量验证，结果发现该基因仅在6号染色体上存在一个杂交信号，说明Scaffold上的两个拷贝为错误组装，进一步修正了基因组组装结果。