60Coγ射线诱导人不同细胞线粒体基因表达改变的研究

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目的:线粒体DNA是细胞内唯一的核外遗传物质,其编码的基因参与细胞氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)和能量代谢。研究发现辐射可以诱导线粒体基因表达水平发生变化,但目前相关研究结果较少且结果不一致。另一方面,核与辐射的意外暴露以及恐怖事件发生时,急需快速、高通量的生物标志物,以应对人群辐射暴露情况下的生物剂量估算。因此,本课题以人淋巴细胞株为主要研究对象,探索初筛得到的7种线粒体基因(ND3.Cyt b、COXⅠ.COXⅡ、COXⅢ、ATPase6和ATPase8)经60Coγ射线照射后在不同时间点的剂量效应关系,以期为探索放射敏感生物标志物和解决放射生物学领域中快速剂量估算这一难题提供科学依据;同时,通过研究辐射对4种不同组织来源的人正常细胞和肿瘤细胞中线粒体基因的影响,探索细胞辐射敏感性预测指标和线粒体基因表达在肿瘤放射治疗中是否存在一定的应用前景。方法:1.以剂量率为1 Gy/min的60Coγ射线进行人淋巴细胞株的照射,研究基因转录水平的表达水平变化时,剂量为0、0.5、1、3、5、8、10和15Gy;研究基因翻译水平的表达水平变化时,剂量为0、1、3、5、8、10、15和18Gy,照射后分别培养4、12、24、48和72h。研究不同组织来源的人正常细胞和肿瘤细胞线粒体基因的表达水平变化时,选择0、3和8Gy,照射后培养24h。2.探索辐射对线粒体基因在转录水平的影响时,利用Real-time PCR方法定量检测线粒体基因的表达水平;探索辐射对线粒体基因在翻译水平的影响时,利用Western Blot方法半定量检测线粒体基因的表达水平。结果:1.在转录水平上,60Coγ射线照射后4h~24h人淋巴细胞7种线粒体基因表达水平显著上调。照射后4h和24h两个时间点上ND3基因转录水平的表达分别在3~10Gy和3~15Gy的范围内呈现良好的剂量效应关系;照射后24h, Cyt b基因转录水平的表达显著增强,并且在0~15Gy的范围内有一定的剂量效应关系;照射后12h,COXⅠ表达显著上调,在5Gy时达峰值,并且在0~5Gy的范围内有一定的剂量效应关系:照射后24h,COXⅢ基因显著增强,在3~10Gy的范围内有良好的剂量效应关系;照射后24h, ATPase6和ATPase8基因呈现随剂量升高而增加的趋势,并且在3~15Gy的范围内线性相关。2.在翻译水平上,60Coγ射线照射后24h、48h和72h人淋巴细胞线粒体COXⅡ基因在翻译水平的表达显著上调,并且呈现良好的线性关系。特别是在48h和72h这两个时间点上,COXⅡ基因表达水平与照射剂量线性相关:而在60Coγ射线照射后4~72h的五个时间点上,ND3和ATPase8基因翻译水平的表达均无明显变化。3.对比60Coγ射线照射后人淋巴细胞COXⅡ、ND3和ATPase8基因在转录与翻译水平的变化趋势,发现4h和12h两个时间点,3种基因的转录和翻译水平的表达变化基本一致。自24h开始,两个水平的表达变化开始出现差异。4.用3和8Gy60Coγ射线照射后24h,人正常肝细胞7个线粒体基因表达水平均明显上调,并且随剂量增加而表达增强。其中,COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ3个基因的表达水平与照射剂量线性相关。其余四种肿瘤细胞在3和8Gy60Coγ射线照射后24h均无显著改变。结论:1.在转录水平上,60Coγ射线照射后24h为研究辐射诱导人淋巴细胞线粒体基因表达改变的最佳时间点,7种线粒体基因均有各自不同的最佳诱导剂量。2.在转录水平上,ND3基因在4h、8h及24h均有一定的剂量效应关系,有可能成为早期的放射损伤标志物;照射后24h, Cyt b、COXⅢ、ND3、ATPase6及ATPase8基因剂量效应关系良好,提示可以作为辐射损伤标志物进一步研究,其中ND3、ATPase6及ATPase8基因表达改变的趋势没有统计学差异,提示有可能将这3种基因联合成为一组辐射损伤生物标志物。3.在翻译水平上,60Coγ射线照射后24、48及72h,COXⅡ基因表达水平有可能成为较好的辐射损伤标志物。4.辐射诱导人淋巴细胞线粒体基因表达在转录与翻译水平上的变化无必然一致性。5.60Coγ射线照射后24h,人正常肝细胞中线粒体基因表达水平显著上调。人肺腺癌细胞线粒体基因表达略有上调,另外3种肿瘤细胞线粒体基因无显著改变。
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