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γ-氨基丁酸（GABA）是哺乳动物中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质,具有降血压、降血氨、抗抑郁和改善睡眠等多种生理功能,在医药、食品及化工等领域应用广泛。目前,GABA主要是通过大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及乳酸菌等耐酸细菌进行制备。细菌合成GABA的过程由其染色体上的谷氨酸脱羧酶系统（GAD system）所介导,包含两个关键蛋白:位于细胞质中的谷氨酸脱羧酶（Gad B或Gad A）和位于细胞膜上的L-Glu/GABA反向转运蛋白Gad C,前者催化胞内L-Glu脱羧反应生成GABA与CO2,后者负责胞外L-Glu的转入与胞内GABA的外排。筛选或构建具有高GAD活性的菌株,并在分析其生理特性基础上建立高效的催化转化体系,对于实现GABA的生物法制备具有重要意义。本文选取大肠杆菌（Escherichia coli）为平台菌株,通过蛋白质工程、代谢工程及细胞形态工程等技术手段,拓宽了Gad B与Gad C催化活性p H范围、重构了E.coli的GAD系统、实现了E.coli细胞形态的定向调控及GABA高效合成。主要研究结果如下:（1）以一株具有GABA合成能力植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）为出发菌株,克隆获取了其染色体上的gad B基因;随后,借助p ET28a载体实现了Gad B于E.coli BL21（DE3）中可溶性表达;而后,采用亲和层析纯化了目的蛋白并研究了其酶学性质。结果表明,该酶最适温度和p H分别为40oC和p H 5.0,其Km、kcat/Km及Vmax值分别为22.33 m M、1.04 s-1m M-1和27.79 U/mg,且金属离子Ca2+、Zn2+和Mg2+对其具有激活作用。在此基础上,利用蛋白质工程手段对Gad B的C-末端进行了定向切除。研究发现,C-末端切除11个氨基酸的突变体(Gad B?C11)呈现最佳的催化活性p H范围,其在p H 6.5和7.0的条件下仍能检测到18.22%（5.06U/mg）和7.79%（2.16 U/mg）的相对酶活性。（2）为实现GAD系统关键基因的协调可控表达,以p ET28a为骨架,设计并构建了基于lac I-PT7lac（乳糖启动子）与ara C-PBAD（阿拉伯糖启动子）的双启动子表达载体。在此基础上,通过分子生物学手段将L.plantarum源gad B?C11与E.coli自身gad C和gad C?C41分别整合至上述载体中,并构建了重组表达载体p TA01L(p ET28a-gad C-ara C-PBAD-gad B?C11)、p TA02L(p ET28a-gad C?C41-ara C-PBAD-gad B?C11)及相应工程菌株。研究显示,IPTG与L-阿拉伯糖（Ara）可分别诱导Gad C(或Gad C?C41)和Gad B?C11表达,但随着IPTG浓度的增加,宿主细胞生长所受到的抑制逐渐增强;在IPTG（12.5μM）和Ara（4 g/L）共诱导体系中,工程菌株E.coli BL21（DE3）/p TA02L于p H 4.7条件下的细胞表观GAD活力达489.24 U/g（细胞干重）,为E.coli BL21（DE3）/p TA01L的1.32倍。结果表明,拓宽GAD系统关键蛋白催化活性p H范围并实现其协调可控表达,可有效提升E.coli的GABA合成性能。（3）为减轻膜蛋白Gad C?C41表达对宿主E.coli的生长抑制效应,将p TA02L质粒进一步转入内含p Lemo载体的E.coli Lemo21（DE3）感受态细胞中,获取工程菌株E.coli Lemo21（DE3）/p TA02L。细胞生长实验分析显示,该宿主有效降低了Gad C?C41的毒性影响;与此同时,将IPTG与Ara共诱导后的E.coli Lemo21（DE3）/p TA02L细胞加入至含有88.3 g L-Glu粉末的200 m L纯水中(OD600为20),37oC、150 rpm且非控制p H条件下反应5 h后,GABA产量高达280.10 g/L,为相同转化体系中对照菌株（E.coli BL21（DE3）/p TA02L）催化效率的1.12倍。（4）为弱化工程菌株细胞被膜屏障阻力,设计并构建了基于lac I-PT7lac、ara C-PBAD与rha RS-Prha BAD（鼠李糖启动子）三启动子表达载体,并在此基础上构建了表达载体p TASR03L(p ET28a-gad C?C41-ara C-PBAD-gad B?C11-rha RS-Prha BAD-sul A)及相应的工程菌株。研究显示,过表达细胞分裂阻遏蛋白Sul A促使E.coli细胞变长且丝状化,细胞体积增大、通透性增强。此外,工程菌株E.coli BL21（DE3）/p TASR03L和E.coli Lemo21（DE3）/p TASR03L呈现出更高的GABA合成效率。在上述催化体系中,反应5 h后,E.coli BL21（DE3）/p TASR03L介导的GABA产量达290.10 g/L,最高GABA时空产率为110.04 g/L/h;而E.coli Lemo21（DE3）/p TASR03L介导的GABA产量则高达300.36 g/L,最高GABA时空产率为120.33 g/L/h。