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蜱传脑炎(tick-borne encephalitis,TBE)又名森林脑炎,是经硬蜱媒介传播的自然疫源性传染病,主要侵犯中枢神经系统,病原体是蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)。据世界卫生组织统计,全球每年有超过10000例蜱传脑炎感染患者;在我国,蜱传脑炎已被列为5大职业性传染病之一。近年来随着国家经济高速发展、旅游业爆发式增长,远足、探险等户外活动兴起,进入森林疫区人群数量呈现逐年上升趋势,蜱传脑炎的发病率也在逐年升高,威胁着广大人民群众的生命健康。此外,蜱传脑炎病毒还是重要的生物战剂之一,美国CDC将其列为病毒C类生物武器。蜱传脑炎致残率高,临床上尚无特异性疗法,主要采用支持治疗和一般对症治疗为主。疫苗接种是预防蜱传脑炎的主要手段之一。当前,大部分蜱传脑炎病毒抗体多是研究用的鼠源性单抗,尚未有全人源TBEV单抗报道。在本研究中,我们拟通过流式分选-单细胞PCR技术,从蜱传脑炎疫苗免疫志愿者体内筛选获得全人源中和单克隆抗体,为蜱传脑炎治疗和预防提供新的途径。实验选取2名健康男性志愿者(25-40岁),在告知并签署知情同意书后按照蜱传脑炎灭活疫苗(长春生物制品研究所有限公司研制)说明书要求,分别在第0天、14天对志愿者进行2次免疫,又在第42天加强免疫1次。采集志愿者第0天、21天、28天、49天和63天血液样本,ELISA检测血清抗体滴度,结果表明两名志愿者均产生了针对TBEV的特异抗体。用Ficoll-hypaque法分离志愿者第49天血液样本20 m L,获得的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)经荧光抗体标记后,用流式细胞分选仪分选出CD19+/CD3-/CD20-/CD27high/CD38high特异的单个抗体分泌细胞。我们先后共计分选获得1632个单细胞克隆,占上样细胞总数的0.02%;经反转录和巢式PCR扩增抗体可变区基因,扩增出重、轻链配对克隆349个,配对克隆的扩增效率约21.38%;对巢式PCR产物进行测序和IMGT/V-QUEST分析,最终获得有用克隆175个。对175个单克隆巢式PCR产物进一步扩增抗体基因可变(V)区,通过重叠延伸PCR技术与抗体启动子-前导序列和恒定区-多聚A尾序列连接,构建出抗体基因重、轻链线性表达框。将抗体线性表达框基因转染到Expi 293F细胞进行表达后,ELISA方法筛选到14株具有结合活性的单克隆抗体。我们进一步验证了这14株结合单抗在BHK-21细胞中对TBEV活病毒的中和效果,发现两株具有一定中和保护能力的单抗1C4和3E12。在抗体浓度达到200μg/m L以上时,1C4和3E12两株单抗对细胞能够起到完全保护效果,其中1C4的保护效果要强于3E12,1C4的IC50值为75μg/m L,而3E12的IC50值为108μg/m L。为对筛选到的抗体作进一步研究,我们在原核系统表达纯化了TBEV抗原E和NS1蛋白。TBEV在病毒分类学上属黄病毒科(Flavivirade)黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA包膜病毒。其抗原成分包括结构蛋白E和非结构蛋白NS1。我们将TBEV抗原E和NS1基因克隆到p ET-32a表达载体上,转化BL21感受态细胞进行诱导表达和纯化,两个蛋白均以包涵体形式表达。NS1蛋白纯化过程以尿素为变性剂,将包涵体溶解后过镍柱纯化,然后通过逐步减少尿素浓度进行透析复性,最后获得纯化的NS1蛋白;E蛋白用相同方法进行纯化时,在复性过程中总是会变成沉淀析出,于是我们尝试采用比较温和的变性剂——十二烷基肌氨酸钠溶解包涵体,然后在含氧化还原体系(GSH和GSSG)的TE缓冲液中进行透析复性,最后获得E抗原蛋白。我们将纯化好的NS1蛋白和E蛋白与志愿者阳性血清分别进行Western Blot和ELISA检测,发现阳性血清只与E蛋白反应而不与NS1蛋白起作用,说明本研究中使用的灭活疫苗有效成分包含抗原E蛋白,而不包含NS1蛋白。将E抗原蛋白包被后与中和单抗1C4、3E12进行ELISA验证,结果表明具有中和活性的1C4和3E12两株单抗与原核表达的E抗原蛋白具有较弱的结合活性,这可能是因为两株单抗本身亲和力较低。考虑到原核表达的抗原蛋白缺乏糖基化修饰;此外,蜱传脑炎病毒膜蛋白pr M在病毒复制成熟过程中也起重要作用,所以我们又分别将抗原pr M-E和NS1基因克隆到真核表达载体p DC316,并在293T细胞中进行了表达。用志愿者阳性血清对293T细胞裂解物进行Western Blot鉴定,可观察到pr M-E蛋白在55 k Da处出现特异性条带,说明pr M-E基因得到表达并能与阳性血清反应;而NS1蛋白无目的条带,考虑是因为NS1蛋白不是灭活疫苗的有效抗原成分,志愿者血清中缺乏抗NS1抗体所致。在Western Blot实验中,我们发现pr M-E抗原在真核表达的细胞裂解物沉淀,在与筛选到的中和单抗单独反应时均难以出现明显目的条带;而将两株单抗混合在一起时,则可以看到明显特异条带。这说明我们筛到的两株中和单抗可能分别结合于抗原E蛋白的不同表位,尽管单独使用时抗原抗体相互作用比较弱,但混合在一起仍可看出明显特异条带。综上所述,本研究基于流式分选-单细胞PCR技术成功从蜱传脑炎灭活疫苗免疫志愿者体内筛选获得2株具有中和活性的单克隆抗体,该抗体可进一步研究用作潜在的治疗蜱传脑炎感染的被动免疫制剂;通过原核和真核表达系统表达了TBEV抗原蛋白E和NS1,其中只有E抗原能与志愿者阳性血清有结合反应,说明灭活疫苗的有效成分包含抗原E蛋白;此外,筛选到的中和单抗与抗原E蛋白具有结合活性,说明两株中和单抗的靶抗原是E抗原。