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背景:海洛因成瘾是脑部疾病,而治疗海洛因成瘾最大的难题在于高复吸率。从中脑腹侧被盖（VTA）投射到伏隔核（NAc）脑区的多巴胺能是现今广为人们认同的用于药物奖赏的一个关键性途径和通路,而从前额皮层（m PFC）投射到NAc核区、再投射到腹侧苍白球的谷氨酸则被认为是引起复吸的共同途径和通路[1]。近来许多研究都已经提示,GABA能系统不但能够有效地调节多巴胺系统,而且它也是一种能够有效地调节谷氨酸能地系统,它在药物地奖赏以及复吸中起着关键性的作用。但关于海洛因的成瘾和复吸过程中GABA能对体内表观遗传学的调控效应研究报道较少,涉及的详细机制有待进一步深入系统研究。目的:本课题主要探索靶向调控NAc脑区GABA受体的rno-mi R-7b和rno-mi R-21-5p在海洛因的成瘾和复吸中的作用及其机制的研究,将有助于加深理解海洛因所致的复杂性精神疾病的发病新机制,并探讨这两种mi RNA作为干预和治疗海洛因成瘾的生物标志物和分子靶标的可能性。实验一:明确在海洛因成瘾和复吸阶段,NAc脑区GABAA受体的α4亚基（GABRA4）,GABAA受体的β2亚基（GABRB2）,GABAB受体的B1亚基（GABBR1）受体m RNA及蛋白表达变化方法:利用模型动物大鼠,通过海洛因自身给药训练,建立海洛因成瘾大鼠模型,随机地将其划分成为两组,其中一组是建模后消退1天并进行条件线索诱导的组别（CS1,模拟奖赏强化阶段）,另外一组是建模后消退14天并进行条件线索诱导的复吸组别（CS14,模拟复吸阶段）,另外再安排一组空白对照（即control组）,除却用生理盐水代替海洛因之外的其他实验操作与处理组相同。前两组在进行线索诱导的复吸测试后立刻取大鼠的伏隔核（the Nucleus accumbens,NAc）进行RT-q PCR与Western Blot实验,定量地分析各组GABRA4,GABRB2,GABBR1受体m RNA及蛋白表达水平的变化。结果:RT-q PCR结果表明,CS1组、CS14和control组三组之间GABRA4,GABRB2,GABBR1受体m RNA的表达都具有统计学差异(F（2,10）=4.694,p=0.037;F（2,10）=9.517,p=0.005;F（2,7）=5.296,p=0.04)。两两组间的比较可以发现,与CS14别比较,另两组的GABRA4 m RNA的表达情况的都有所下调（p＜0.05;p＜0.05）;除此之外,与对照组相比较,另外两组的GABRB2 m RNA表达情况均有极显著性的下调（p＜0.01;p＜0.01）;而CS1组和CS14组的GABBR1受体m RNA表达分别与control组相比,均有显著性的下降（p＜0.05;p＜0.05）。Western Blot结果表明,GABRA4,GABRB2,GABBR1受体的蛋白表达在上述三组间有显著性差异(F（2,6）=34.552,p=5.1×10-4;F（2,6）=5.503,p=0.044;F（2,6）=32.203,p=0.001)。两两组间的比较可以发现,与空白对照组别比较,另两组的GABRA4蛋白的表达情况的都有所上调（p＜0.05;p＜0.01）;除此之外,与对照组相比较,另外两组的GABRB2受体表达情况均有极显著性的下调（p＜0.05;p＜0.05）;而CS1组和CS14组的GABBR1受体的蛋白分别与control组相比,都极显著的下降（p＜0.01;p＜0.01）。实验二:预测并筛选调控NAc脑区GABRA4,GABRB2,GABBR1受体亚型的目标rno-mi RNA方法:根据实验室前期的海洛因成瘾的差异mi RNA表达谱结果,通过targetscan7.1数据库预测并筛选NAc脑区调控各种GABA受体亚型的目标rno-mi RNA,进行比对分析,最终找到NAc脑区靶向调控GABA受体GABRA4,GABRB2,GABBR1亚型的目标rno-mi RNA。结果:根据海洛因成瘾的差异mi RNA表达谱,并结合targetscan7.1数据库生物信息学预测分析推测,NAc脑区调控GABRA4,GABRB2和GABBR1受体亚型的目标rno-mi RNA有rno-mi R-7b和rno-mi R-21-5p。实验三:大鼠海洛因成瘾和复吸中,验证NAc脑区rno-mi R-7b和rno-mi R-21-5p的表达变化方法:取实验一中三组别,进行复吸测试后,取NAc,提取总RNA,并且进行RT-q PCR,明确大鼠海洛因成瘾和复吸中NAc脑区内rno-mi R-7b和rno-mi R-21-5p表达的变化。结果:one-way ANOVA统计分析结果表明,CS1组、CS14和control组三组之间NAc脑区rno-mi R-7b和rno-mi R-21-5p表达具有统计学差异((F（2,8）=7.505,p=0.015;(F（2,9）=10.174,p=0.005))。两两组间比较发现,CS1组的rno-mi R-7b表达显著高于control组,但CS14组的rno-mi R-7b极显著低于CS1组（p＜0.05;p＜0.01）;而CS14组的rno-mi R-21-5p表达与control组相比,有极显著的升高（p＜0.01）,上述RT-q PCR验证结果与测序结果基本保持一致。实验四:在细胞水平,利用双荧光素酶报告实验验证rno-mi R-7b和rno-mi R-21-5p分别对GABRA4,GABRB2和GABBR1靶基因直接作用情况方法:根据targetscan7.1在线数据库预测rno-mi R-7b与靶基因GABRA4,rno-mi R-21-5p与靶基因GABRB2和GABBR1的直接作用序列位点,构建这三种靶基因的野生质粒与突变质粒,分别转染rno-mi R-7b和rno-mi R-21-5p质粒,rno-mi R-7b和rno-mi R-21-5p空载质粒于293T细胞,转染48小时后检测各组报告基因荧光表达情况,判断预测的mi RNA是否能够直接抑制相应靶基因的表达。结果:实验结果通过统计分析表明,GABRA4基因的表达水平在三个实验处理组rno-mi R-7b+GABRA4-3’UTR-1组,rno-mi R-7b+GABRA4-3’UTR-2组和rno-mi R-7b+GABRA4-3’UTR-3组分别显著低于GABRA4-WT-NC+rno-mi R-7b组(t（4）=10.970,p=3.92×10-4;t（4）=14.338,p=1.37×10-4;t（4）=13.584,p=0.004),同时,上述三个实验处理组中的GABRA4基因的表达水平也分别显著低于GABRA4-MU+rno-mi R-7b组(t（4）=-7.491,p=0.002;t（4）=-18.934,p=4.6×10-5;t（4）=-19.008,p=4.5×10-5);GABRB2基因的表达水平在GABRB2-WT+rno-mi R-21-5p组分别显著低于GABRB2-WT-NC+rno-mi R-21-5p和GABRB2-MU+rno-mi R-21-5p组(t（4）=10.932,p=3.98×10-4;t（4）=22.159,p=2.5×10-4);GABBR1基因的表达水平在GABBR1-WT+rno-mi R-21-5p组分别显著低于GABBR1-WT-NC+rno-mi R-21-5p和GABBR1-MU+rno-mi R-21-5p组(t（4）=20.963,p=3.1×10-5;t（4）=11.121,p=3.72×10-4)。上述实验结果表明,rno-mi R-7b能与靶基因GABRA4,而rno-mi R-21-5p均能直接结合靶基因GABRB2和GABBR1的3’UTR,并抑制相应靶基因的表达。实验五:探索过表达rno-mi R-7b后海洛因成瘾大鼠复吸行为的改变及NAc脑区GABRA4受体m RNA和蛋白表达的变化情况方法:将建模成功大鼠随机分成CS14组,阴性病毒处理后消退14天后复吸诱导组（AAV-GFP组）,rno-mi R-7b过表达处理后消退14天复吸诱导组（AAV-rno-mi R-7b overexpression组）。利用脑立体微量注射在NAc脑区对AAV-GFP组和AAV-rno-mi R-7b overexpression组分别进行腺病毒注射,腺病毒会在NAc内转染,14天后进行海洛因复吸行为测试,行为测试后迅速将大鼠麻醉断头,取NAc脑区进行RT-q PCR与WB实验。结果:one-way ANOVA统计结果发现CS14组,AAV-GFP组和AAV-rno-mi R-7b overexpression组的海洛因复吸的有效鼻触数之间具有显著性的差异(F（2,22）=6.124,p=0.008)。两两组间比对发现,大鼠NAc脑区过表达rno-mi R-7b后海洛因复吸的有效鼻触数均显著高于CS14组和阴性病毒组（p＜0.01;p＜0.01）。RT-q PCR结果表明rno-mi R-7b表达和GABRA4的m RNA在上述三组之间存在显著性差异(F（2,6）=5.778,p=0.04;F（2,11）=5.528,p=0.022),两两组间比对发现,大鼠NAc脑区过表达rno-mi R-7b后,CS14组和阴性病毒组中模型动物NAc脑区的rno-mi R-7b表达显著低于实验处理组（p＜0.05;p＜0.05）,而GABRA4的m RNA的表达水平分别和CS14组、阴性病毒组相比显著下降（p＜0.05;p＜0.01）。Western Blot结果表明NAc脑区过表达rno-mi R-7b组,CS14组和阴性病毒组之间的NAc脑区的GABRA4受体的蛋白表达没有显著的差异性（p＞0.05）。实验六:探索注射AAV-si RNA-GABRA4后海洛因成瘾大鼠复吸行为的改变及GABRA4受体蛋白表达的变化情况方法:将建模大鼠随机分为CS14组,AAV-GFP组和NAc脑区AAV-si RNA-GABRA4注射后消退14天复吸诱导组（AAV-GABRA4 inhibition）。海洛因自身给药模型大鼠,NAc脑区立体定位,分别微量注射AAV-GFP或AAV-si RNA-GABRA4,转染14天,随后测试动物的海洛因复吸行为,后迅速将大鼠麻醉断头,取NAc脑区进行WB实验测定各组NAc脑区GABRA4受体蛋白表达的变化。结果:one-way ANOVA统计结果发现CS14组,AAV-GFP组和AAV-GABRA4inhibition组的海洛因复吸的有效鼻触数之间具有显著性的差异(F（2,20）=6.988,p=0.005)。两两组间比较发现,大鼠NAc脑区抑制GABRA4后海洛因复吸的有效鼻触数均显著高于CS14组和阴性病毒组（p＜0.01;p＜0.01）。WB结果表明,NAc脑区GABRA4受体的蛋白表达在上述组别间具有显著差异(F（2,8）=20.056,p=0.001)。两两组间比较发现,大鼠NAc脑区抑制GABRA4后,相比CS14组、阴性病毒组,NAc脑区GABRA4的蛋白的表达水平均显著下降（p＜0.01;p＜0.01）。实验七:探索抑制rno-mi R-21-5p后海洛因成瘾大鼠复吸行为的改变及NAc脑区GABRB2和GABBR1受体m RNA及蛋白表达的变化情况方法:在成功建立海洛因自身给药模型大鼠后,随机分为海洛因复吸对照组（CS14,n=9）,阴性病毒处理组（n=8）和rno-mi R-21-5p干扰组（n=8）。于NAc脑区对海洛因自身给药模型大鼠分别微注射阴性病毒和抑制rno-mi R-21-5p的病毒表达载体,在脑内成功转染14天后进行大鼠海洛因复吸行为测试。行为测试后迅速将大鼠麻醉断头,取NAc脑区组织,分别用RT-q PCR和Western Blot进行rno-mi R-21-5p、GABRB2和GABBR1受体m RNA表达及GABRB2和GABBR1受体蛋白表达水平的检测。结果:one-way ANOVA统计结果发现AAV-rno-mi R-21-5p抑制组,AAV-GFP组和CS14组之间的大鼠海洛因复吸的有效鼻触数存在显著的统计学意义(F（2,17）=6.925,p=0.006)。两两组间比较发现,大鼠NAc脑区抑制rno-mi R-21-5p后海洛因复吸的有效鼻触数均分别显著低于阴性病毒组和CS14组和（p＜0.01;p＜0.05）。RT-q PCR结果表明rno-mi R-21-5p表达、GABRB2和GABBR1的m RNA表达水平在上述三组之间存在显著性差异(F（2,13）=19.753,p=1.15×10-4;F（2,9）=8.753,p=0.008;F（2,9）=7.109,p=0.014),两两组间比较发现,大鼠NAc脑区抑制rno-mi R-21-5p后,NAc脑区的rno-mi R-21-5p表达极显著低于另两组（p＜0.01;p＜0.01）,而GABRB2和GABBR1的m RNA的表达水平分别和CS14组、AAV-GFP组相比明显升高（p＜0.01;p＜0.01;p＜0.05;p＜0.01）。WB结果显示,NAc脑区GABBR1受体的蛋白表达在以上组别间存在显著的统计学意义(F（2,9）=6.427,p=0.018)。两两组间比对发现,大鼠NAc脑区抑制rno-mi R-21-5p后,NAc脑区GABBR1的蛋白的表达水平分别与CS14组、阴性病毒组相比均显著上调（p＜0.05;p＜0.05）。实验八:探索过表达GABRB2和GABBR1受体蛋白后海洛因成瘾大鼠复吸行为的改变及NAc脑区GABRB2和GABBR1受体蛋白表达的变化情况方法:将建模大鼠随机分为CS14组,AAV-GFP组,NAc脑区过表达GABRB2或GABBR1组。海洛因自身给药模型大鼠,NAc脑区立体定位,分别微量注射AAV-GFP,GABRB2或GABBR1过表达病毒载体,成功转染两周后进行大鼠海洛因复吸行为测试。行为测试后迅速将大鼠麻醉断头,取NAc脑区进行WB实验测定各组间NAc脑区GABRB2或GABBR1蛋白表达水平变化。结果:one-way ANOVA统计结果发现CS14组,AAV-GFP组和GABRB2或GABBR1过表达组的海洛因复吸的有效鼻触数存在显著性的差异(F（2,19）=12.651,p=3.22×10-4;F（2,22）=4.534,p=0.022)。LSD法比较发现,大鼠NAc脑区过表达GABRB2后海洛因复吸的有效鼻触数均显著低于CS14组和阴性病毒组（p＜0.01;p＜0.01）;大鼠NAc脑区过表达GABBR1后海洛因复吸的有效鼻触数均显著低于CS14组和阴性病毒组（p＜0.05;p＜0.01）。Western Blot结果表明,NAc脑区过表达GABRB2或GABBR1后,GABRB2或GABBR1受体的蛋白表达在上述三组之间存在显著性差异(F（2,9）=7.658,p=0.011;F（2,9）=7.319,p=0.013)。两两组间比较发现,大鼠NAc脑区过表达GABRB2后,NAc脑区GABRB2的蛋白的表达情况分别和另两组相比均显著上调（p＜0.01;p＜0.01）;同样,大鼠NAc脑区过表达GABBR1后,NAc脑区GABBR1的蛋白的表达水平分别和CS14组、阴性病毒组相比均显著上调（p＜0.01;p＜0.01）。结论:本研究的结果可以发现,相比空白对照,成瘾大鼠NAc脑区rno-mi R-7b和rno-mi R-21-5p表达均显著性上调,而复吸大鼠NAc脑区前者显著性下调,但后者的表达却进一步显著升高;并且海洛因觅药行为会随着对海洛因成瘾大鼠于NAc脑区过表达rno-mi R-7b或特异性的敲减GABRA4蛋白的表达而明显增加,而抑制rno-mi R-21-5p或分别过表达GABRB2受体和GABBR1受体均显著减少海洛因觅药行为;结果提示GABA受体的GABRA4、GABRB2和GABBR1亚型参与海洛因的成瘾和复吸过程。进一步实验推测,NAc脑区rno-mi R-7b可通过直接作用于GABRA4基因,而mi R-21-5p作用于GABRB2和GABBR1基因参与海洛因成瘾和复吸。总结上述所有的实验数据,有关于海洛因成瘾和复吸过程中,这两种mi RNA如何调控相应靶基因的表达以及具体的表观遗传学机制已经初步描述。它将有助于重新认识海洛因成瘾和复吸的机制,以便于这两种mi RNA及其相对应的靶点能够作为临床上防治海洛因成瘾和复吸的有可能的生物标志物与靶标。