目的:　　随着对乳腺癌的研究不断加深，人们逐渐认识到乳腺癌是一种全身性的疾病，治疗乳腺癌的重点已经不再只是以手术治疗为主，而是转向注重全身治疗的新模式，新辅助化疗的出现就是其中最重要的一种治疗模式。新辅助化疗也称术前化疗，是在乳腺癌进行局部治疗之前给予的全身化疗。经过几个周期的化疗后患者的临床分期能够降低，这不仅使那些本不能手术切除的患者得以手术，还能使部分原本不符合保乳条件的患者有机会行保乳治疗。对无临床症状的微小转移，可控制其发展。还可以获得化疗方案的体内敏感度信息，进行针对性治疗，提高治疗有效率。目前，新辅助化疗已成为2013版中国抗癌协会乳腺癌诊治指南的规范治疗方案。目前，临床治疗大多采用经验性化治疗方案进行用药，由于疾病异质性及个体差异的影响，患者对治疗的反应存在显著差异，在经验性用药后约有20-30％的新辅助化疗患者对化疗药物耐药甚至在化疗期间出现肿瘤进展，这不仅增加了患者的经济负担，而且极有可能延误了局部治疗的时机，从而严重影响患者的预后与生存质量。因此如果能筛选出可以方便快捷的预测新辅助化疗敏感性的标记物，将对乳腺癌患者新辅助化疗的选择评估和探索乳腺癌化疗耐药的机制具有重要价值。　　MicroRNAs(miRNAs)是一类崭新的内源性非编码小RNA，在转录后水平负性调控基因的表达。某些在肿瘤中异常表达的miRNA被证实与肿瘤对某些药物的耐受有关。学者们发现miRNA可能通过多种途径参与肿瘤化疗耐药，如通过调节药物转运和代谢的酶降低细胞内的药物浓度;影响细胞周期停滞、凋亡和DNA修复的细胞损伤反应;提升癌细胞侵袭转移能力等。通过对乳腺癌耐药细胞株的研究发现多个miRNA与乳腺癌的耐药相关。目前，有乳腺癌耐药相关的基因蛋白的检测和体外化疗药物敏感试验被用于预测乳腺癌化疗的耐药，这都是基于肿瘤穿刺组织学标本检测。关于血清miRNA与乳腺癌的化疗耐药的研究非常少，这是因为既往的研究认为RNA不能稳定的存在于血液当中，会被血液中的酶降解，无法准确定量的被检测出来。但目前的研究发现循环中的miRNAs分子可以独立于细胞之外，不能被血液中降解其他RNA分子的酶降解，从而能明显保持稳定。现有的技术，包括定性和定量miRNAs分子的技术、PCR技术等，能快速地建立起miRNA为基础的早期检测系统，这种新技术相对于其他早期诊断系统更易于检测（标本易获取、用量低），比传统的蛋白分子标记方法将更加有效，这也克服分子标记在抗体制备和定量分析上发展所遇到的瓶颈。如果可以用血清miRNA作为预测乳腺癌新辅助化疗疗效的生物学指标，患者将免于肿瘤穿刺的痛苦和诸多不便，成为一个方便、快捷的预测指标。这对行乳腺癌新辅助化疗的患者无疑是具有非常重要的显示临床意义。　　本研究收集2010年至2012年于我科行新辅助化疗治疗患者的临床资料以及治疗前的血清标本，比较分析临床及病理指标与疗效的关系;比较我院新辅助化疗耐药组与有效组之间血清miRNA表达的差异，筛选出预测乳腺癌新辅助化疗敏感性的方便快捷的血清学miRNA指标;探讨血清miRNA在乳腺癌化疗耐药中发挥作用的可能机制。　　方法:　　一、研究对象　　2010年1月1日至2012年12月31日，于中国医科大学附属盛京医院乳腺外科收治的行TEC方案新辅助化疗治疗的初治女性乳腺癌患者。所有患者在化疗前经空心针穿刺作病理学明确诊断，病理类型均为浸润性导管癌。征得患者的知情同意后收集患者临床资料及相关流行病学信息，在进行新辅助化疗前采集血样，采集外周静脉血，3小时内常规离心，分离血清，分装后-80℃低温保存。　　MCF-7细胞株为本实验室保存的人乳腺癌细胞传代细胞系。　　二、实验方法　　统计分析新辅助化疗治疗118例患者的临床资料，比较分析年龄、肿瘤大小、淋巴结状态、ER、PR、Her-2的表达以及乳腺癌分子分型等指标与疗效的关系，寻找能够影响新辅助化疗疗效的相关因素。　　通过miRNA基因芯片比对新辅助化疗耐药组患者与敏感组患者之间血清miRNA表达的差异。　　采用实时荧光定量PCR的方法进一步扩大检测新辅助化疗耐药组与敏感组的血清样本量，验证血清miRNA-451在两组之间是否存在差异表达。　　采用低浓度持续诱导的方法建立多西他赛的乳腺癌细胞系MCF-7/DOC和表阿霉素耐药的乳腺癌细胞系MCF-7/EPI。　　采用实时荧光定量PCR的方法检测多西他赛的乳腺癌细胞系MCF-7/DOC和表阿霉素耐药的乳腺癌细胞系MCF-7/EPI与化疗敏感的MCF-7细胞系之间是否存在miRNA-451差异表达。　　采用生物预测软件及网站预测miRNA-451调控的靶mRNA和蛋白　　转染miRNA-451 mimic和miRNA-451 inhibitor进入MCF-7、MCF-7/EPI及MCF-7/DOC细胞中，采用实时荧光定量PCR的方法检测转染miRNA-451 mimic和miRNA-451 inhibitor后，能否有效调控三种细胞中miR-451的表达。　　采用AnnexinⅤ-APC/PI双标法检测转染miRNA-451 mimic/inhibitor后三种细胞株的凋亡水平的变化。　　采用Western-blot方法检测转染miRNA-451 mimic/inhibitor后三种细胞中Bcl-2和Caspase3的表达，以便明确miRNA-451与Bcl-2和Caspase3蛋白在乳腺癌多耐药发生中的作用机制。　　结果:　　1.我科118例新辅助化疗乳腺癌患者耐药的发生率为32.2％，基线资料比较中患者的年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期情况，均无统计学差异(P＞0.05)。统计学结果显示ER阳性组与ER阴性组、PR阳性组与PR阴性组新辅助化疗疗效有差异，且均有统计学意义(P＜0.05); HER-2低表达组新辅助化疗疗效好于过度表达组，但无统计学意义(P＞0.5)。统计学结果显示三阴型乳腺癌组与luminal A型乳腺癌组、luminal B型乳腺癌组、HER-2过表达型乳腺癌组新辅助化疗疗效有差异，且均有统计学意义(P＜0.05); HER-2过表达型乳腺癌组、luminal A型乳腺癌组和luminal B型乳腺癌组之间新辅助化疗疗效无明显差异(P＞0.5)。　　2.乳腺癌新辅助化疗耐药组与乳腺癌新辅助化疗有效组的血清miRNA基因芯片检测结果相比，有统计学意义的上调表达的miRNA有17个，有统计学意义的下调表达的miRNA有28个。　　3.新辅助化疗耐药组与新辅助化疗敏感组血清中miR-451的表达相比较，耐药组中血清miR-451的表达水平明显更低，表达差异有显著性(P＜0.01)　　4.成功建立多西他赛耐药的乳腺癌细胞系MCF-7/DOC和表阿霉素耐药的乳腺癌细胞系MCF-7/EPI。　　5.表阿霉素耐药的MCF-7/EPI与表阿霉素敏感的MCF-7中miR-451的表达相比较，MCF-7/EPI中血清miR-451的表达水平明显更低，表达差异有显著性(P＜0.01)。多西他赛耐药的MCF-7/DOC与多西他赛敏感的MCF-7中miR-451的表达相比较，MCF-7/DOC中血清miR-451的表达水平明显更低，表达差异有显著性(P＜0.01)。　　6.采用生物预测软件及网站预测miRNA-451靶向作用于Bcl-2。　　7.转染miRNA-451 mimic过表达miRNA-451后，MCF-7、MCF-7/EPI及MCF-7/DOC三种细胞中miRNA-451的表达量与对照组相比都明显提高，差异有显著性(P＜0.01)。转染miRNA-451 inhibitor抑制miRNA-451，三种细胞中miRNA-451的表达量与阴性对照组相比都呈现相应的下降。　　8.MCF-7、MCF-7/EPI及MCF-7/DOC细胞在转染miRNA-451 mimic后，三种细胞的凋亡水平均都均有不同程度的增加，与对照组相比较差异有显著性(P＜0.01);但是在转染miRNA-451 inhibitor后，与对照组相比，三种细胞的凋亡水平均没有一个明显下降的趋势。　　9.MCF-7、MCF-7/EPI及MCF-7/DOC细胞在转染miRNA-451 mimic后，三种细胞中的Bcl-2蛋白的表达与对照组相比明显下调，差异有显著性(P＜0.01)。同时，三种细胞中的Caspase3蛋白的表达与对照组相比明显上调，差异有显著性(P＜0.01)。　　结论:　　1.血清循环miR-451在乳腺癌新辅助化疗耐药和敏感患者中的表达存在显著差异。　　2.miR-451在乳腺癌表阿霉素和多西他赛耐药细胞系与乳腺癌化疗敏感细胞系中的表达存在显著差异。　　3.血清循环miRNA-451检测方便、快捷，可以作为预测乳腺癌新辅助化疗耐药的生物标志物，具有一定临床应用价值。　　4.miR-451可能通过调节Bcl-2和Caspase3调控细胞凋亡从而影响新辅助化疗敏感性。