论文部分内容阅读
犬瘟热（CD）是犬及其肉食动物常见多发的一种由犬瘟热病毒（CDV）引起的病毒性疾病,该病的宿主范围广,临床症状多变,给该病的诊断和治疗带来了很大的困难,且该病的发生机理目前还没有明确的研究。中药作为天然药物的主要成分,具有抗病毒的活性。本课题采用咖啡酸作为研究对象,首先在体外对咖啡酸抗CDV的活性进行研究,确定其具有抗CDV的效果并筛选出最佳抑制浓度,其次在宿主细胞上探索其机制。因此,本试验将从体外咖啡酸抗CDV的能力上,研究咖啡酸对CDV感染细胞后诱发的炎症、Nectin-4受体、TLR3表达、炎性通路和细胞凋亡几个方面的影响。采用MTT法检测咖啡酸和利巴韦林对Vero细胞的毒性,从而确定了半数细胞毒性浓度(CC50)。96孔板接种100TCID50病毒液筛选出咖啡酸抑制CDV的最佳抑制浓度,采取三种给药方式（先加药再接种病毒、病毒与药物同时作用、先加病毒后给药）作用于Vero细胞2h吸去上清,加入不同剂量的咖啡酸,根据CPE法测定咖啡酸的抗病毒作用。结果发现咖啡酸在体外对于CDV具有治疗作用,且在1h和2h最佳抑制病毒的浓度分别为23.3μg/mL和32.3μg/m L,选择指数均大于6。采用时间梯度试验检测咖啡酸体外抗病毒的能力,结果显示咖啡酸在1h和2h均可以显著抑制病毒子代的繁殖能力,且咖啡酸协同阳性药物利巴韦林可以更好的预防CDV的繁殖。采用一步法荧光定量PCR检测其治疗后的病毒含量均小于病毒对照组,表明随着时间梯度的增加,咖啡酸可以显著在体外抑制CDV的增殖。进一步探索咖啡酸抗CDV的作用机制,采用荧光定量PCR方法检测不同时间段CDV在MDCK细胞上的增殖情况。结果发现病毒在24h产量最高,48h和72h逐步递减,75μg/mL和50μg/mL的咖啡酸能在CDV感染细胞24h和48h内显著抑制病毒子代繁殖。采用荧光定量PCR的方法检测咖啡酸对CDV感染的MDCK细胞的治疗后所产生的IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10和TGF-β的基因表达情况。结果表明75μg/mL和50μg/mL的咖啡酸可显著抑制IL-6的mRNA表达;75μg/mL、50μg/mL和25μg/mL的咖啡酸能显著抑制TNF-α的mRNA表达;75μg/mL的咖啡酸能显著抑制IL-1β的mRNA的表达。CDV能够显著增加TGF-β和IL-4两个抑炎因子mRNA的表达,且不同浓度的咖啡酸均能促进抑炎因子的表达。采用ELISA检测咖啡酸对CDV感染的MDCK细胞IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ分泌的影响。结果表明,CDV能显著增加IL-6、IFN-β和IFN-γ的分泌,而75μg/mL和50μg/mL的咖啡酸可以显著降低IL-6的分泌,但是对IFN-β和IFN-γ的分泌量影响不显著。通过荧光定量PCR检测Nectin-4受体和TLR3表达情况,结果表明CDV感染MDCK细胞72h后可以显著增加Nectin-4受体的mRNA的表达,且不同浓度的咖啡酸都能显著抑制Nectin-4受体mRNA的表达。CDV感染MDCK细胞后,可以显著促进TLR3 mRNA的表达,且75μg/mL和50μg/mL的咖啡酸能显著上调TLR3的表达;以poly（I:C）感染MDCK细胞,检测咖啡酸对感染poly（I:C）后的MDCK细胞中的TLR3表达情况。结果表明75μg/mL的咖啡酸能显著降低TLR3的表达,咖啡酸可以通过参与调节TLR3表达从而发挥作用。采用Western blot检测ERK、SRC和p65蛋白表达情况,结果表明CDV对p-ERK和p-SRC的表达无影响,但是可以促进p-p65的上调,加入50μg/mL和25μg/mL的咖啡酸后可以显著下调p-p65的表达。高浓度CDV持续感染MDCK细胞作用72h后细胞开始出现凋亡现象,采用Annexin-V、JC-1和Caspase-3酶的流式细胞术检测,结果表明CDV持续感染细胞72h后,细胞出现显著凋亡现象,且不同浓度的咖啡酸可以显著促进细胞凋亡。综上所述,咖啡酸在体外对先病毒感染后加药物进行治疗,具有显著抑制病毒繁殖的作用。咖啡酸在72h可以降低CDV引起的Nectin-4受体的表达,调节TLR3的表达,下调CDV诱导的p-p65的表达,从而抑制CDV诱导的MDCK细胞的炎性因子的表达和分泌。咖啡酸可以通过促进CDV感染的细胞发生细胞凋亡从而发挥抗病毒感染的作用。结果表明,咖啡酸可以作为治疗犬瘟热病毒的潜在药物。