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目的1.探讨 MNAT1 在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达及意义。2.观察MNAT1对NSCLC细胞的增殖、周期、凋亡及迁移的影响。3.分析MNAT1对NSCLC细胞凋亡及细胞周期相关蛋白的影响及其机制。方法1.MNAT1在NSCLC组织和NSCLC细胞的表达(1)用生物信息学及数据库分析MNAT1在NSCLC组织及正常肺组织中的表达差异。(2)收集南方医院近两年48例NSCLC组织及配对正常组织标本,用免疫组化法检测MNAT1的表达水平,分析其与NSCLC临床病理学特征之间的关系。(3)用 RT-PCR 法检测肺癌细胞株 spc-a-1、H322、A549、H446、H460、H1299中MNAT1的mRNA表达水平,用western bolt检测NSCLC细胞株中MNAT1的蛋白表达水平高低。2.构建MNAT1低表达细胞株及MNAT1过表达细胞株并验证(1)结合NSCLC细胞株RT-PCR及western blot实验结果,选取高表达MNAT1的NSCLC细胞株A549、H322,进行siRNA瞬时转染,干扰MNAT1的表达并检测其干扰效果。选取低表达MNAT1的NSCLC细胞株H1299,进行真核过表达载体转染,过表达目的基因MNAT1,并检测其表达效率。(2)MNAT1稳定干扰的慢病毒载体的构建并对NSCLC细胞株A549、H322进行稳定转染。转染后在荧光显微镜下观察细胞荧光率、使用PCR荧光定量法和western blot法检测其稳转效率。3.MNAT1对NSCLC细胞的增殖、周期、凋亡及迁移的影响(1)利用MTT实验和平板克隆实验来检测NSCLC细胞在体外的增殖能力,(2)将稳定干扰细胞株A549-shMNAT1和A549-shNC注射至裸鼠皮下,两周后观察裸鼠的皮下成瘤情况,检测瘤体大小。(3)用流式细胞仪检测MNAT1低表达及过表达时细胞周期及凋亡的改变。(4)用划痕实验、transwell实验检测NSCLC细胞的迁移能力。4.分析MNAT1对NSCLC细胞的凋亡和细胞周期相关蛋白的影响。利用western bolt实验检测MNAT1对NSCLC细胞的凋亡和细胞周期相关蛋白影响,并分析其可能潜在的通路。5.检测数据全部采用SPSS20.0软件进行统计学分析。独立样本两组之间的比较则采用独立样本t检验,表示为3次独立实验的均数±标准差。用χ2检验分析MNAT1在NSCLC组织中的表达与其患者的临床病理参数之间的关系。结果1.MNAT1在NSCLC组织中表达上调,在NSCLC细胞株中呈差异表达。(1)生物信息数据库分析表明MNAT1在NSCLC组织中的表达高于正常肺组织。免疫组化检查结果与数据库结果相一致,MNAT1在NSCLC组织中表达较正常肺组织中的表达水平高(P<0.001)。(2)在临床病理参数方面,MNAT1在NSCLC组织中的表达水平与NSCLC的转移有关,其差异具有统计学意义(P<0.05)。而与患者的年龄、性别、吸烟与否、肿瘤的病理类型、肿瘤大小,单发或者多发、肿瘤部位、是否有EGFR突变等不相关,其差异没有统计学意义(P>0.05)。2.MNAT1低表达及过表达细胞株的构建及验证结果(1)siRNA干扰细胞株的构建及验证用MNAT1 siRNA干扰片段转染NSCLC细胞株A549和H322,WB检验干扰效率,筛选干扰效率最高的si-MNAT1#2片段,构建瞬时转染细胞株H322-si-MNAT1、H322-si-NC、A549-si-MNAT1和 A549-si-NC。WB 验证干扰效率成功(p<0.001)。(2)过表达质粒载体的构建及验证购买MNAT1过表达质粒载体,经测序验证没有序列突变、序列缺失,转染至细胞株H1299,RT-PCR及western bolt验证,过表达载体构建成功。MNAT1在H1299细胞株中成功过表达。(3)MNAT1稳定干扰载体的构建购买MNAT1稳定干扰的慢病毒载体,测序检测成功插入靶基因。稳定转染A549、H322 NSCLC细胞株。荧光显微镜下观察细胞荧光率、荧光定量PCR和western blot实验验证稳转后的效率,细胞株H322-shMNAT1、H322-shNC和A549-shMNAT1、A549-shNC,构建成功,干扰组表达低于NC组(P<0.001)。3.MNAT1对NSCLC细胞的增殖、周期、凋亡及迁移的影响(1)MNAT1对NSCLC细胞的体外增殖能力的影响MTT实验结果显示,MNAT1的低表达抑制了 NSCLC细胞的生长速度(P<0.005)。而过表达MNAT1则使细胞的生长加快(P<0.05)。平板克隆形成实验的结果与MTT实验结果相一致。即,抑制MNAT1后,实验组的NSCLC细胞克隆形成数量显著减少(P<0.01)。过表达MNAT1后,实验组的NSCLC细胞克隆形成数量显著增多(P<0.01)。(2)MNAT1对NSCLC细胞体内增殖能力的影响A549细胞在裸鼠皮下成瘤后,测量瘤体大小,剥除瘤体,做免疫组化,检测瘤组织的Ki-67的表达情况。我们发现,裸鼠形成的瘤体中,MNAT1敲低组的瘤体大小比对照组的瘤体小,差异具有统计学意义(P<0.05)。MNAT1的敲低组Ki-67表达也降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)MNAT1对NSCLC细胞的周期的影响流式细胞仪结果显示,与对照组相比较,MNAT1表达下降后G1期细胞百分比显著增多(P<0.01),S期细胞百分比减少(P<0.05)。而过表达MNAT1后,G1期细胞百分比减少(P<0.05),S期细胞百分比增多(P<0.05),说明MNAT1的表达参与了 NSCLC细胞周期的进程。低表达MNAT1可使细胞周期停滞在G1期,过表达MNAT1则可加快细胞周期。(4)MNAT1对NSCLC细胞凋亡的影响流式细胞学结果显示,与对照组相比较,MNAT1表达下降后早期凋亡和晚期凋亡细胞百分比增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)MNAT1对NSCLC细胞迁移能力的影响在划痕实验中,结果显示,与对照组相比较,MNAT1的低表达可使细胞迁移能力下降(P<0.05),而MNAT1过表达,可使细胞的迁移能力增强(P<0.05)。Transwell实验结果显示,与对照组相比,MNAT1低表达时,细胞的迁移能力显著下降(P<0.001)。而MNAT1的过表达,细胞的迁移能力增强(P<0.05)。4.检测MNAT1对NSCLC细胞凋亡和细胞周期相关蛋白的影响及机制分析。MNAT1的表达,使Akt磷酸化增加,周期相关蛋白p21、p27蛋白表达受到抑制,cyclinD1表达增加,凋亡相关蛋白Bax表达减少、caspase3裂解片段的表达增加。因此,MNAT1可能是通过影响Akt的磷酸化,进而影响周期及凋亡相关蛋白,使细胞周期进程加快,抑制凋亡。结论1.NSCLC组织中MNAT1的表达高于正常肺组织且与NSCLC淋巴结转移相关。2.MNAT1在NSCLC细胞中的表达能促进细胞增殖、加快细胞周期进程,减少细胞凋亡,并促进细胞迁移。3.MNAT1可能通过影响Akt的磷酸化,进而影响细胞周期及凋亡相关蛋白,使细胞周期进程加快,抑制凋亡。