血吸虫病是由于人或哺乳动物感染了血吸虫所引起的一种疾病。在我国，血吸虫病仍然流行于长江以南的12个省市自治区，未得到完全控制。血吸虫寄生在终宿主的血管内，以宿主红细胞为主要食物和营养物质来源，通过分解宿主红细胞的血红蛋白来获得生长发育所需的氨基酸，但对于血吸虫分解血红蛋白的具体分子机制迄今还是未知。近年来研究发现组织蛋白酶B、C、D和L在红细胞的降解过程中发挥了重要作用，其中组织蛋白酶L又是血吸虫消化道内的一种重要组织蛋白酶，对血吸虫降解血红蛋白及血吸虫的自身繁殖起非常重要的作用。该蛋白和人类的组织蛋白酶L有较大的差异，有望成为新的抗血吸虫病药物的作用靶点或疫苗研究的目标蛋白。而且日本血吸虫的组织蛋白酶L又可能可以激活TGF-β，在TGF-β发挥复杂的功能前起作用。因此，血吸虫组织蛋白酶L基因的克隆及功能的研究有助于探索血吸虫致病的分子机制，对于提高血吸虫病的防治水平具有重要意义。 研究目的： 本研究根据日本血吸虫组织蛋白酶L2(SjCL2)基因设计引物，以期克隆该基因。但测序证实为类似sjCL2的未知功能基因SjCLs，采用基因克隆和重组表达技术，构建日本血吸虫组织蛋白酶L样(SjCLs)基因的原核表达系统，表达得到重组蛋白后，研究SjCLs的性质及功能。 研究方法： (1)提取日本血吸虫成虫总RNA，并根据已知SjCL2基因序列设计特异引物，经RT-PCR和PCR扩增SjCLs基因。将目的基因连接至pMD18-T Simple载体上，连接产物转化大肠杆菌TOP10，重组质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。采用Clustal W软件对SjCLs基因与GeneBank发表的其它组织蛋白酶基因进行比对。再利用生物信息学网站ExPASy及SWISS提供的软件对本研究克隆到的SjCLs基因与同源性最高组织蛋白酶L基因——SjCL2进行比较分析，预测二者之间结构和功能的差异。 (2)将SjCLs基因定向亚克隆至原核表达载体pET-30a(+)，构建pET-SjCLs原核表达载体，并转化大肠杆菌BL21(DE3)以建立表达SjCLs重组融合蛋白的工程菌株。用IPTG诱导重组蛋白的表达，使上述工程菌株高效表达目的蛋白。目的表达产物采用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行纯化，对表达的重组融合蛋白及纯化产物进行SDS-PAGE分析和免疫反应性检测。以Z-Phe-Arg-Nmec为底物，测定融合蛋白的酶活性。 (3)采用兔抗鼠TGF-β1血清，对日本血吸虫尾蚴cDNA表达文库进行免疫学筛选，对阳性克隆进行PCR扩增后，将大于500 bp的克隆进行复筛，对复筛阳性的克隆进行测序和生物信息学鉴定。 结论： (1)从日本血吸虫中克隆到一个新的类似SjCL2的组织蛋白酶L基因——SjCLs，并构建了原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达获得了大量的重组蛋白，该重组蛋白具有类似于SjCL2的酶活性，说明SjCLs基因是组织蛋白酶L家族的一个成员。 (2)SjCHGC蛋白与兔抗鼠TGF-β1抗体的反应为交叉反应，用抗某一蛋白的抗体筛选表达文库得到相应蛋白的基因序列的方法不一定可行。