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[研究背景与目的]心血管疾病是全球范围内导致人类死亡的最主要原因之一,而衰老是心血管疾病发生的一个重要的独立危险因素。研究衰老的发生机制和减缓衰老的有效干预措施对心血管疾病的防治具有重要意义。文献报道,硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)具有拮抗衰老的作用,但其具体机制仍未完全阐明。沉默信息调节蛋白2同源物1(silent information regulator 2 homolog 1,SIRT1)是一种高度保守的NAD+依赖性蛋白脱乙酰基酶,可通过使叉头转录因子1(forkhead box O transcription factor 1,Fox O1)脱乙酰基化来抵抗氧化应激,从而延缓衰老。H2S可调节SIRT1的表达及活性。本研究旨在探讨SIRT1/Fox O1信号通路在H2S拮抗过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)衰老中的作用。[实验方法与结果]1.采用0、25、50和100μmol/L H2O2处理内皮细胞1 h,更换新鲜完全培养基后继续培养细胞24 h,SA-β-gal染色以及western blot检测细胞衰老相关蛋白P53、P21、PAI-1的表达,以确定H2O2诱导HUVECs衰老的最适浓度。SA-β-gal染色结果显示,100μmol/L H2O2组的阳性细胞数明显增加,约是对照组的8.4倍(P<0.01)。Western blot结果显示,与对照组相比,100μmol/L H2O2组的P53、P21和PAI-1蛋白表达分别增加了60.5%、5.8倍和1.6倍(P<0.01)。2.分别采用0、25、50、100、200μmol/L的外源性H2S供体Na HS预先处理HUVECs 30 min,更换新鲜无血清培养基,100μmol/L H2O2再作用1 h后,更换新鲜完全培养基继续培养24 h。结果显示,与H2O2组相比,100μmol/L Na HS组的SA-β-gal阳性细胞数以及P53、P21和PAI-1蛋白表达分别下降了43.8%、49.7%、49.4%和67.6%(P<0.01)。3.细胞随机分为三组:对照组、100μmol/L H2O2组、100μmol/L Na HS+100μmol/L H2O2组,检测各组SIRT1、Fox O1、Ac-Fox O1、Mn SOD和catalase的蛋白表达,DCFH-DA荧光染色检测细胞内ROS的水平,改良的生物素转换法测定SIRT1的硫-巯基化情况。结果显示,与对照组相比,H2O2组的SIRT1、Fox O1、Mn SOD和catalase蛋白表达分别减少了61.4%、28.3%、43.9%和45.4%(P<0.05),但Ac-Fox O1/Fox O1比值与ROS水平分别增加了84%和2.8倍(P<0.01);Na HS+H2O2组与H2O2组相比,SIRT1、Fox O1、Mn SOD和catalase的蛋白表达分别增加了2.2倍、84.1%、38%和38.7%(P<0.01),而Ac-Fox O1/Fox O1比值和细胞ROS水平分别下降了48.4%和46.2%(P<0.05)。此外,与对照组和H2O2组相比,Na HS+H2O2组的硫-巯基化SIRT1显著增加(P<0.01)。4.细胞随机分为四组:对照组、H2O2组、Na HS+H2O2组和Na HS+H2O2+Fox O1 si RNA组。HUVECs长至亚融合状态,更换新鲜无血清培养基,50 nmol/L Fox O1si RNA处理细胞24h,再用Na HS孵育30min后换H2O2处理1h,更换完全培养基继续培养24h。检测SA-β-gal阳性细胞数、SIRT1、Fox O1、Ac-Fox O1、Mn SOD和catalase的蛋白表达,以及细胞内ROS水平的变化情况。结果显示,与Na HS+H2O2组相比,Na HS+H2O2+Fox O1 si RNA组的SA-β-gal阳性细胞数、P53、P21和PAI-1的蛋白表达以及ROS水平分别增加了39%、65.5%、1.9倍、1.5倍和1.6倍(P<0.01),而Mn SOD与catalase的蛋白表达分别下降了80%和67.6%(P<0.01)。[结论]H2S可拮抗H2O2诱导的HUVECs衰老,其机制与上调SITR1的表达以及硫-巯基化SIRT1,降低Fox O1乙酰化水平,增加Mn SOD、catalase的表达和减少细胞内ROS的生成,从而抑制氧化应激有关。