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研究目的:牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)在干细胞治疗,组织工程与再生领域中广泛应用。但是年龄对人牙周膜干细胞的生物学和免疫学特性的作用影响尚待明确。研究方法:1.根据患者年龄分为年轻组(19-20岁)及年老组(35-50岁),采用组织块法体外分离培养不同年龄组的牙周膜干细胞。2.检测两组牙周膜干细胞生物学特性的差异:通过流式细胞术比较两组牙周膜干细胞的表面分子(Stro-1,CD146,CD31和CD45)表达的差异;通过CCK-8及EdU染色法比较两组牙周膜干细胞增殖能力的差异;通过Annexin V-PE/7-ADD染色比较两组牙周膜干细胞凋亡能力的差异;将两组牙周膜干细胞同期行成骨及成脂诱导,7天后进行碱性磷酸酶染色及活性定量测定,21天后进行茜素红染色及定量测定,14天后进行油红O染色及定量测定,以比较两组牙周膜干细胞的成骨及成脂分化潜能的差异。3.检测两组牙周膜干细胞免疫学特性的差异:通过流式细胞术比较两组牙周膜干细胞的表面分子(HLA-Ⅰ,HLA-Ⅱ DR,CD80和CD86)表达的差异;将两组牙周膜干细胞分别与异体的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)共培养,并通过五种不同的共培养方式,用EdU染色法比较分别与两组牙周膜干细胞共培养过的外周血单个核细胞增殖能力的差异;通过Annexin V-PE/7-ADD染色比较分别与两组牙周膜干细胞共培养过的外周血单个核细胞凋亡水平的差异。4.探究两组牙周膜干细胞生物学及免疫学特性差异的潜在机制:通过基因芯片技术比较两组牙周膜干细胞中差异表达的基因,并通过qRT-PCR及Western-blot技术验证两组牙周膜干细胞中的高差异表达的基因和蛋白。研究结果:1.成功分离培养两组牙周膜干细胞,分为年轻组(YPDLSCs)及年老组(APDLSCs)。2.APDLSCs的生物学特性较YPDLSCs明显变弱:APDLSCs中Stro-1和CD146的阳性表达率均低于YPDLSCs;APDLSCs的增殖能力明显弱于YPDLSCs;APDLSCs的凋亡水平较YPDLSCs明显升高;成骨诱导7天后,APDLSCs的碱性磷酸酶活性较YPDLSCs显著降低,成骨诱导21天后,APDLSCs的的矿化结节生成量较YPDLSCs明显减少,成脂诱导14天后,APDLSCs的脂滴形成数量及大小较YPDLSCs明显变少,即APDLSCs成骨及成脂分化潜能明显弱于YPDLSCs。3.APDLSCs 的免疫学特性较 YPDLSCs 明显变弱:HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ DR、CD80和CD86的表达率在APDLSCs与YPDLSCs中无统计学差异,APDLSCs与YPDLSCs均表达低免疫原性;APDLSCs与YPDLSCs均能抑制异体外周血单个核细胞的增殖,但APDLSCs的免疫抑制能力弱于YPDLSCs;分别与APDLSCs和YPDLSCs共培养过的外周血单个核细胞的凋亡水平无统计学差异。4.基因芯片结果显示,APDLSCs与YPDLSCs相比,免疫相关基因(CCND3和RC3H2)的mRNA表达上调,成骨相关基因(Runx2,ALP,COL1A1)、成脂相关基因(PPARγ2)、以及其他免疫相关基因(CXCL12,FKBP1A,FKBP1B,NCSTN,P2RX7,PPP3CB,RIPK2,SLC11A1 和 TP53)的 mRNA表达下调。qRT-PCR及Western-blot检测证实了 APDLSCs与YPDLSCs相比,成骨及成脂相关基因和蛋白(RUNX2,ALP,COL1A1和PPARγ2)的表达水平明显降低,免疫相关基因和蛋白(CCND3)的表达水平增高最为显著。结论:年龄对牙周膜干细胞的生物学和免疫学特征具有重要影响,年轻组牙周膜干细胞的增殖能力、多向分化潜能及免疫抑制能力明显优于年老组牙周膜干细胞。这项实验结论提示我们在用牙周膜干细胞治疗牙周炎或牙齿再生时,应尽量选择来自年轻个体的牙周膜干细胞。除此之外,我们应注意年轻个体的牙周膜干细胞的储存,以供衰老后有临床治疗需要时使用,或供其他需要牙周膜干细胞异体移植的老年人使用。