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【研究背景】尿石症是泌尿系统诸多疾病中较为常见的一种疾病,流行病学研究的结果显示中国成年人群体中尿石症发病率为5.8%,其中70%-80%结石成分主要为草酸钙。目前治疗尿石症的主要手段为手术治疗,然而术后的结石复发率很高,5-10年的复发率约为50%,而20年内的结石复发率高达75%,与此同时尚未存在行之有效的手段能够抑制结石的复发,大多数患者一生中因为肾结石的复发需要接受多次治疗,严重影响患者及其家庭的生活质量。因此,进一步揭示草酸钙结石的确切发病机制,寻找新的有效的干预靶点,具有重要的科研和临床价值。在关于草酸钙结石发病机制的研究中,氧化应激学说是目前比较公认的一种学说。当尿液中的草酸浓度过高时,会刺激肾小管上皮细胞产生过量的ROS,导致细胞出现氧化应激损伤(OS),损伤的肾小管上皮细胞会为草酸钙提供黏附的位点,且草酸能够和钙离子结合以草酸钙晶体的形式析出,然后在细胞的损伤位点上黏附、聚集和生长,最终形成结石。因此,如果有办法干预肾脏中ROS的生成,那么或许就可以借此干预草酸钙结石的形成。人体中的ROS主要由线粒体和NADPH所产介导产生,而既往大量文献已经证实了其ROS在草酸钙肾结石发生发展过程中的作用。我们前期研究发现氯喹能够通过抑制线粒体所产生的ROS来抑制氧化应激损伤,继而抑制大鼠肾脏草酸钙晶体的沉积,但其是否可以通过NADPH氧化酶调控ROS的生成及氧化应激损伤目前仍不清楚。【目的】本实验拟通过体外细胞和体内动物模型证实氯喹对高草酸诱导的肾小管上皮细胞和大鼠肾组织氧化应激损伤,以及大鼠肾脏草酸钙晶体沉积的抑制作用,并揭示NAPDH氧化酶在氯喹抑制高草酸诱导的肾小管上皮细胞氧化应激损伤及肾脏草酸钙晶体沉积过程中的作用及机制,从而深入揭示氯喹抑制高草酸诱导的肾脏氧化应激损伤及草酸钙晶体沉积的的分子机制,并为草酸钙结石的临床防治提供新的实验依据和干预靶点。【材料和方法】首先通过乙二醇法构建大鼠肾脏氧化应激损伤及草酸钙晶体沉积模型,灌胃给予氯喹进行干预,利用HE染色、Pizzolate染色和偏光显微镜观察,以及免疫组化染色法检测氯喹干预对于大鼠肾脏氧化损伤、草酸钙晶体沉积和NADPH氧化酶表达的影响;然后通过试剂盒检测氯喹预处理对高草酸诱导的肾小管上皮细胞氧化应激损伤相关指标变化的影响,并通过实时荧光定量PCR和Western Blot检测氯喹对NADPH表达及PKC信号通路活化的影响;最后通过大鼠模型进一步验证PKC信号通路在氯喹调控NADPH表达、肾脏氧化应激损伤及草酸钙晶体沉积中的作用。【结果】1、氯喹对乙二醇诱导的大鼠肾脏草酸钙晶体沉积的影响对照组和单独氯喹处理组大鼠肾脏均无明显的晶体沉积,造模组大鼠肾脏出现大量的草酸钙晶体沉积;与造模组相比,氯喹干预组的草酸钙晶体沉积明显减少,而结石造模+PMA组的晶体沉积明显增加;与氯喹干预组相比,结石造模+氯喹+PMA组大鼠肾脏的晶体沉积显著增加。2、氯喹对乙二醇诱导的大鼠肾脏氧化应激损伤的影响与对照组相比,单独氯喹组大鼠肾脏组织的氧化应激损伤没有明显变化,结石造模组大鼠肾脏组织的氧化应激损伤明显加重;与造模组相比,氯喹干预组大鼠肾脏组织的氧化应激损伤显著减轻,而造模+氯喹+PMA组大鼠的损伤明显加剧;与氯喹干预组相比,结石造模+氯喹+PMA组大鼠的肾脏组织的氧化应激损伤明显加剧。3、氯喹对大鼠肾脏NADPH氧化酶表达的影响与对照组相比,造模组大鼠肾组织NADPH氧化酶NOX2和NOX4及其亚基p22phox、p47phox的表达均显著增加,但Rac1的表达无明显变化;与造模组相比,氯喹干预组的NOX2、NOX4及其亚基p22phox、p47phox的表达均显著降低,造模+PMA组的NOX2和NOX4的表达则显著增加;与氯喹干预组相比,结石造模+氯喹+PMA组大鼠肾组织的NOX2和NOX4的表达明显升高。4、氯喹对高草酸诱导的肾小管上皮细胞(NRK-52E)氧化应激损伤的影响高草酸刺激可以明显抑制细胞活性,促进LDH、H2O2、ROS的释放,降低GSH的含量,而氯喹预处理可以显著削弱高草酸的作用。5、氯喹对NRK-52E细胞NADPH氧化酶表达的影响氯喹可以呈时间和剂量依赖性的抑制NOX2和NOX4的表达,并可以显著削弱高草酸诱导的NOX2和NOX4表达上调。6、氯喹对高草酸诱导的NRK-52E细胞PKC激酶活化及表达的影响与对照组相比,高草酸刺激可以明显上调PKCa和PKCδ的磷酸化水平,氯喹预处理则可以显著削弱高草酸诱导的PKCa和PKCδ的磷酸化水平,但对PKCa和PKCδ的总蛋白表达则无明显影响。【结论】1.氯喹能够显著抑制高草酸诱导的大鼠肾小管上皮细胞和肾组织的氧化应激损伤。2.氯喹能够显著抑制乙二醇诱导的大鼠肾脏草酸钙晶体的沉积。3.氯喹可以通过抑制PKCa和PKCδ的活化而下调NADPH氧化酶的表达,从而抑制高草酸诱导的大鼠肾组织的氧化应激损伤。