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转化酶(Invertase,Inv)(又称β-D-呋喃果糖苷酶,P-D-fructofuranosidase EC3.2.1.26)在植物中广泛存在,催化蔗糖不可逆的裂解形成葡萄糖和果糖。该酶参与植物的韧皮部装载和卸载、生长发育、生物和非生物胁迫应答并在光合产物同化碳分配中起关键调控作用,是决定作物经济产量的关键酶。在橡胶树中,橡胶生物合成是以蔗糖为原料在乳管中进行的,蔗糖的降解利用效率是影响橡胶产量的一个关键因素。生理生化研究的证据已经表明,胶乳转化酶定位于细胞质胞液(胶乳C-乳清),属于中性／碱性转化酶,是调控胶乳蔗糖代谢和影响橡胶产量的关键酶。但是,由于该酶极易失活,所以对该酶的生化特性与蛋白表达研究还相当匮乏,也不清楚纯化的胶乳主要转化酶的分子与生化特性。本文研究中,笔者从橡胶树胶乳C-乳清中分离纯化了中性／碱性转化酶,分析了其酶学相关特性,利用质谱分析明确了胶乳的主要转化酶(基因),制备了其多克隆抗体,采用蛋白印迹技术分析了不同条件下该蛋白的表达水平,为深入的揭示中性／碱性转化酶参与乳管蔗糖降解调控,以及与橡胶产量的关系奠定了良好基础。本论文的主要结果如下：1、纯化了橡胶树胶乳转化酶。以橡胶胶乳为材料,通过高速离心获得胶乳C-乳清,然后经过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300凝胶过滤层析和DEAE-Sephacel离子交换柱层析等纯化步骤,转化酶的纯化倍数达29倍,获得SDS-PAGE检测可辨认的目标蛋白条带,但活性得率仅为0.5%。2、明确了胶乳的主要转化酶及其基本分子特性。通过对SDS-PAGE目标蛋白条带的二级质谱分析,证明纯化获得的胶乳主要转化酶系中性／碱性转化酶,其编码基因为HbNIN2,进一步确认了本实验室的已有研究结果；利用SDS-PAGE图谱和表观分子大小标准曲线测定该转化酶的表观分子量为69kDa;糖基化试剂盒检测表明,在胶乳C-乳清中该转化酶无糖基化修饰。3、分析了纯化胶乳转化酶的酶促动力学和生化特性。胶乳转化酶酶活的最适温度为45℃、最适pH为7.6；Lineweaver-Burk法测得酶促降解蔗糖的Km值为18.69mmol/L, Vmax值为1.33μmol/min;蔗糖降解产物果糖、葡萄糖对酶的抑制常数Ki值分别为38mmol/L、74mmol/L。4、所纯化的中性/碱性转化酶的酶活受多种金属离子与生化试剂影响,盐酸吡哆辛和盐酸吡哆醛明显促进其酶活性,而Cu2+、Hg2+、Ag+、Zn2+、Co2+、Fe3+和Mn2+等重金属离子(?)PMSF、EDTA严重抑制其酶活性。5、初步研究了胶乳中转化酶的表达特性。采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephacel离子交换柱层析等手段对HbNIN2多克隆抗体进行纯化,用于Western blotting蛋白表达分析。在未开割树胶乳C-乳清中,HbNIN2蛋白的表达随割次呈现先下降后上升的趋势,与酶活性和基因表达变化的趋势一致；伤害处理明显上调C-乳清中HbNIN2蛋白的表达与酶活：不同植物激素(或生长调节剂)处理对C-乳清中HbNIN2蛋白的表达和酶活影响不同,甲基茉莉酸处理后蛋白表达和酶活呈下降趋势,乙烯利和细胞分裂素处理后蛋白表达和酶活呈上升趋势,赤霉素处理后蛋白表达和酶活呈现先下降后上升的趋势,水杨酸、生长素(2,4-D)和脱落酸处理对蛋白表达和酶活的影响都不大；在三个橡胶树推广品系PR107、热研7-33-97和热研8-79的C-乳清中,热研7-33-97品系的HbNIN2蛋白表达最强,热研8-79品系次之,PR107品系最弱；在三种橡胶树组织(胶乳、叶片和树皮)中,HbNIN2蛋白表达量在胶乳中的最高,叶片其次,树皮最低。结合以往有关HbNIN2基因的表达信息,本文发现在多种处理条件下HbNIN2的蛋白水平和酶活与基因表达水平间并无明显的相关性,表明转录后调控可能也是胶乳转化酶HbNIN2基因表达调控的主要手段。