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背景及目的同种异体输血( allogeneic blood transfusion, ABT)发挥临床治疗作用的同时，也会并发很多免疫相关的副作用。输血相关免疫调节((transfusion-relatedimmunomodulation,TR工M)是输血导致免疫系统改变的以免疫抑制为特征的综合征，TR工M发生的确切机制尚不清楚。临床常见的并发TR工M导致免疫抑制的严重后果为术后感染和肿瘤的复发与转移。一方而，血液在保存过程中，红细胞悬液中的白细胞和血小板释放的多种生物活性物质会随储存时间延长而浓度升高，这些活性分子随血液输入机体内，可能是引起输fffL相关急性肺损伤(Transfusion-related acute lung injury,TRALI)、系统性炎症反应综合征(system is inflammatory response syndrome ,SIRS)等一系列不利TR工M的原因。目前，由于临床输血的复杂性，有关TR工M发生的临床报道仍存在争议，对于库存红细胞输注引起受者的炎症反应，尚需要相关的基础研究支持。此外，库存红细胞输注造成的炎症反应机制国内外尚无定论，这也是本研究的切入点。目前的研究己知，各种刺激信号必须与其相应靶细胞膜上的受体结合，通过其特定的信号传导通路发挥生物学作用。核因子KB (nuclear factor kappaB,N F-KB)作为多种信号传导途径中的枢纽，是转录调控多种炎性因子的中心环节和共同通路。静息状态下，NF-KB复合物与抑制因子工KB相结合，处于无活性状态。在不同的刺激因素作用下，不同的上游信号可导致工KB蛋白磷酸化、泛素化而被蛋白酶降解，NF-KB复合物被释放出来并向核内迁移，激活靶基因的转录。可见NF-KB活化的关键是工KB的降解和复合物的核移位。SN50是NF-KB抑制剂，能特异性阻止NF-KB自细胞浆移至核内，从而抑制NF-KB的DNA结合活性。本研究通过检测工KB-a蛋白水平的变化，同时使用SN50阻断NF-KB的活化，探讨NF-KB的信号途径在库存红细胞输注引起受者炎症反应中的作用。另一方而，NK细胞可以直接杀伤肿瘤细胞和受感染的细胞，在天然免疫应答和炎症中都发挥着重要作用。目前在一些肿瘤治疗上，发现异源反应性NK细胞显示出比自体或相容NK细胞更强的杀伤活性。那么通过异体输血主动发挥NK细胞异源反应作用，可能是预防和逆转输血相关免疫抑制的关键环节。NK细胞表而的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)能够特异性识别并结合靶细胞表而的HLA一工类分子，传导抑制或活化信号，决定着NK细胞异源反应性的发挥。K工R分为抑制型(DL)和活化型(D S)受体两组，均能与其特定的配体结合，分别介导抑制性或活化性反应。当供者NK细胞的抑制性受体不能与其HLA一工类分子配体结合或者与受者的HLA一工类分子不相容时，同时‘供受者HLA一工类抗原不合，就会产生抗白血病的NK细胞异源反应性。探讨能否像交叉配血一样，在肿瘤患者输血前做K工R和HLA一工类分子配型，诱导产生NK细胞的异源性反应，将为不利TR工M的预防和逆转提供新的思路。方法第一部分:1将制备好的悬浮红细胞(红细胞保养液为CPDA)，保存于4 0C;分别于保存1d, 21d和35d <D1, D21和D35)，无菌条件下取出30m1血液，1 SOOrpm离心20min得到上清，将上清12, S OOrpm再次离心Smin以去除细胞，将上清分装后于一20 0C冻存备用。2新鲜分离健康献血者外周血单个核细胞(PBMC，在24孔板中，以2X1护个细胞/孔培养于总体积为l .5m1的完全1640培养基中。PBMC分组:Cl)未加LPS组:分别加入相当于总体积20%的Dl, D21和D35的悬浮红细胞上清，培养48hrs后收集细胞培养上清冻存待检;C2)加LPS组:分别加入总体积20%的Dl, D21和D35分离的上清，培养24hrs后，加入终浓度为100ng/ml的LPS，再继续培养24hrs后收集细胞培养上清冻存待检;两组都分别设空白对照(不加红细胞上清，其他按分组处理)。3检测10份Dl, D21和D35红细胞上清的游离血红蛋白、钾、钠、钙、氯离子浓度，其中包括用于细胞培养的7份上清。4用ELISA试剂盒分别检测细胞培养上清中细胞因子儿-1p、工L-6,IL-lO,IL-17, TNF-a, TGF-p及GM-CSF的浓度变化。第二部分:1按第一部分方法进行细胞培养，48hrs后收获细胞，用蛋白免疫印迹法<western blot)检测IKB-a蛋白水平的变化。2用NF-KB特异性阻断剂SN50处理后，检测细胞培养上清中TNF-a浓度的变化。细胞分组:(1)单加LPS组，(2)单加SN50组，(3) SN50预处理组;每组都设空白对照(不加红细胞上清，其他按分组处理)。第三部分:用PCR-SSP方法对献血员进行K工R分型，按照供血者的K工R与受血者HLA-工类分子不同匹配程度分组，进行回顾性病例一对照研究。白血病组共53例，实体瘤组共27例。在输血前及输血后Sd内分别采集受血者外周静脉血，用流式细胞术和ELISA方法分别检测受fffL者输fffL前后的CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+,CD19+, CD3-CD56+细胞的百分比和血清中细胞因子TNF-a, IFN-y的浓度变化。结果1悬浮红细胞上清液中，FHb, K+, Ca2+的含量随保存时间延长而逐渐增高CP<0.05}，N a+则逐渐降低(P<0.05}，各项受检指标均在国家规定血液质量正常范围内。2在LPS诱导下，D35与Dl的红细胞上清相比，促进了PBMC分泌TNF-a和IL-6 CP<0.05}; TGF-p则逐步减少(P<0.05} o3在LPS诱导下，随加入红细胞上清的保存时间延长，PBMC的工KB-a降解逐渐增加。4加入SN50抑制TNF-a的产生(P<0.05 ) o5患者血清中IFN-y的浓度随着献血者KIR与患者HLA一工类分子不相合程度的加大而增加(P<0.05;在患者输血后，血清中IFN-y浓度的变化与患者NK细胞数的变化显著相关(r=0.60175 } P<0.0001) o结论1随悬浮红细胞保存时间的延长，输血会增强LPS诱导的受者的炎症反应，这为进一步阐明临床严重创伤患者大量输血后的相关免疫反应提供了理论依据。2工KB-a降解的逐渐增加，说明库存红细胞上清能促进LPS诱导NF-KB的活化作用;而SN50能够抑制这种效应，推论NF-KB信号途径，参与了库存红细胞上清协同增强LPS诱导的炎症反应。3供/受血者KIR与HLA不相合程度与肿瘤患者输血后免疫功能的变化有关，这为进一步应用异源反应NK细胞逆转输血相关免疫抑制作用提供了实验依据。