目的中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤后轴突再生困难的主要原因是由于髓鞘轴突抑制分子的存在,目前已经发现的髓鞘抑制蛋白有Nogo-A、髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein, MAG)和少突胶质细胞-髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein, OMgp),三者拥有一个共同的受体(Nogo-66 receptor, NgR)。NgR是一种和糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)相连接的轴突表面蛋白,它和三种抑制因子结合后,通过跨膜的协同受体p75,LINGO-1或TROY形成受体复合物,将抑制性信号传导至细胞内,从而抑制轴突的再生。因此NgR是整个抑制环节的中枢,预测将其阻断有可能促进中枢神经损伤后轴突的再生。本课题的目的在于利用以重组腺病毒为载体的NgR特异性shRNA转染缺血再灌注大鼠脑组织,观察其对缺血再灌注后大鼠脑组织NgR的表达、轴突再生及神经行为的影响,阐明NgR在中枢神经系统(central nervous system, CNS)轴突再生障碍信号转导途径中的重要作用,以期为临床脑缺血后神经康复的基因治疗奠定基础。方法1.应用人胚肾293细胞扩增重组腺病毒,采用赛多利斯腺病毒纯化试剂盒纯化病毒,TCID50测定病毒滴度;2.应用高、中、低三种滴度(剂量)的重组腺病毒和腺病毒保存液(阴性对照)转染大鼠缺血脑组织,采用组织病理学观察局部炎症反应,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,筛选出最佳的转染滴度;3.采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion, MCAO)/再灌注模型,42只大鼠随机分为7组:假手术组,脑缺血2h再灌注24h、2w组(缺血再灌注组)和重组腺病毒载体Ad-shRNA-NgR干预24h、2w组(腺病毒干预组),重组腺病毒载体Ad-shRNA-HK干预24h、2w组(阴性对照组)。采用RT-PCR检测缺血侧皮质和海马NgR mRNA水平,Western blotting检测NgR蛋白表达;4. 20只大鼠随机分为假手术组,缺血再灌注组和腺病毒干预组,阴性对照组。脑缺血2h再灌注24h、9w后行增强CT测量脑梗死体积,术后每隔一周进行神经行为学评分,生物素葡聚糖胺(BDA)神经示踪技术观察皮质脊髓束和皮质红核束。结果:1.重组腺病毒转染293细胞后,荧光显微镜下可观察到明确的绿色荧光,扩增并纯化后Ad-shRNA-NgR的滴度为:3.16×1010 pfu/ml;Ad-shRNA-HK的滴度为:2.84×1010pfu/ml。2.高、中、低剂量组大鼠脑组织均出现GFP阳性表达,且高、中剂量组转染效率明显高于低剂量组,但高剂量组与中剂量组无明显差异。HE染色显示,仅高剂量组中大鼠脑组织有炎性浸润,余均未发现炎性反应。3.与假手术组相比,脑缺血2h再灌注24h、2w后,NgR mRNA和蛋白水平均明显增高(p<0.01),腺病毒干预后NgR mRNA和蛋白表达水平下调(p<0.01),而阴性对照组中NgR mRNA和蛋白表达无明显变化(p>0.05)。4.增强CT扫描提示腺病毒治疗后脑梗塞体积较缺血再灌注组和阴性对照组没有明显变化(p>0.05),而腺病毒治疗3w后,神经功能有明显的恢复(p<0.01),腺病毒治疗9w后健侧皮质红核束发出侧枝支配病灶侧的数量明显增多(p<0.01)。结论:腺病毒能高效、低毒地转染缺血脑组织,有效地进行NgR特异性shRNA基因转导。脑缺血再灌注后皮质和海马的NgR mRNA及蛋白表达升高,腺病毒介导RNAi可以明显降低其表达水平,增加神经解剖学可塑性,促进神经功能的恢复。