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苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis是全球应用较广的微生物农药,其产生的伴孢晶体毒素Cry毒素可以直接用于防控农业害虫;或者将Bt基因转入农作物中,可以有效减少化学杀虫剂的使用。由于Bt毒素对人体无害、对环境友好,使得Bt生物农药在农业害虫防控中广泛长期应用。斜纹夜蛾Spodoptera litura,甜菜夜蛾Spodoptera exigua和草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是世界各地对农业作物有严重危害的三种灰翅夜蛾属Spodoptera（Noctuidae）迁飞能力较强的杂食性昆虫。通过检测这三种昆虫对Bt毒素敏感性差异,从分子水平探究导致这种差异的原因,为有效防控和治理农业害虫提供一定的理论支持。1 三种灰翅夜蛾属昆虫对Bt毒素敏感性分析不同鳞翅目昆虫对Bt毒素敏感性不同,其原因是由于Bt毒素活化过程介导的敏感性差异或毒素与受体蛋白结合过程介导的敏感性差异。通过实验检测三种灰翅夜蛾属昆虫对Cry毒素的敏感性,用40 μg/g的Cry1Ac毒素处理斜纹夜蛾S.litura、甜菜夜蛾S.exigua和草地贪夜蛾S.frugiperda二龄幼虫七天后,结果发现,其存活率分别是96.43%、72.73%和0,三种昆虫对Cry1Ac毒素敏感性存在显著差异（p<0.05）。用40 μg/g的Cry1Ca毒素处理这三种昆虫二龄幼虫七天后,其存活率分别是48.21%,47.27%和3.63%,表明斜纹夜蛾和甜菜夜蛾对Cry1Ca毒素敏感性无差异,这两种昆虫对Cry1Ca毒素敏感性明显低于草地贪夜蛾（p<0.05）。综合分析体重变化和存活率,结果显示,斜纹夜蛾和甜菜夜蛾对Cry1Ca毒素敏感性明显强于Cry1Ac毒素（p<0.05）,草地贪夜蛾对Cry1Ac和Cry1Ca毒素都比较敏感。2 ABC转运蛋白和钙黏蛋白基因的克隆与生物信息学分析Bt毒素与毒素受体蛋白结合的不同是昆虫对Bt毒素产生敏感差异的主要原因,Bt毒素对鳞翅目昆虫产生毒性的过程中,ABCC2转运蛋白和钙黏蛋白是两类重要的毒素受体蛋白。我们从灰翅夜蛾属昆虫中肠或细胞系中分别克隆受体基因,构建pie2-SlABCC2-GFP、pie2-SeABCC2-GFP和pie2-SfABCC2-GFP三种表达质粒。分别将构建的质粒转染至Hi5细胞,结果发现,这三种昆虫ABCC2转运蛋白均主要定位在细胞膜上。斜纹夜蛾,甜菜夜蛾和草地贪夜蛾ABCC2基因分别编码1344、1343和1345个氨基酸残基,其分子量大小分别为150.15 kDa,149.74 kDa和150.25 kDa,且三种不同ABCC2蛋白序列高度保守,一致性达97.42%,均为12次跨膜蛋白。分别从斜纹夜蛾和甜菜夜蛾幼虫中肠克隆SlCAD和SeCAD基因,通过基因合成获得SfCAD基因,分别构建钙黏蛋白表达质粒,转染至Hi5细胞,结果发现SlCAD、SeCAD和SfCAD蛋白都主要定位在细胞膜上。斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾钙黏蛋白基因分别编码1757、1739和1734个氨基酸残基,分子大小分别是197.47 kDa、196.45 kDa和195.50 kDa,三种昆虫钙黏蛋白序列一致性为83.92%。3 ABCC2转运蛋白与Cadherin的协同作用为检测三种灰翅夜蛾属昆虫ABCC2转运蛋白和钙黏蛋白是否可以作为Cry毒素特异性受体,将构建的真核细胞表达质粒分别转染至Hi5细胞,测得Cry1Ac毒素对转染pie2-S1ABCC2-GFP、pie2-SeABCC2-GFP 和 pie2-SfABCC2-GFP 的 Hi5 细胞 EC50 分别是 4.198μg/mL、0.092 μg/mL 和 0.064 μg/mL;而 Cry1Ac 毒素对转染 pie2-SlCAD-GFP、pie2-SeCAD-GFP和pie2-SfCAD-GFP的Hi5细胞无毒性,因此从细胞水平上看,这三种昆虫单独表达钙黏蛋白的都不能作为Cry1Ac毒素受体。用Cry1Ca处理表达这六种蛋白的Hi5细胞,结果发现处理组与对照组病变率无明显差异,因此从细胞水平上看,三种灰翅夜蛾属昆虫单独表达的ABCC2转运蛋白或钙黏蛋白都不能作为Cry1Ca毒素受体。pie2-HaABCC2-GFP和pie2-HaCAD-GFP共转染至Hi5细胞,细胞对Cry1Ac毒素敏感性分别是单独转染pie2-HaABCC2-GFP和单独转染pie2-HaCAD-GFP的6.41倍和541.88倍,由此可见,棉铃虫ABCC2和CAD共同表达能增强Hi5细胞对Cry1Ac毒素的敏感性,即共转染pie2-HaABCC2-GFP和pie2-HaCAD-GFP有较强的协同作用;将斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾三种昆虫ABCC2和钙黏蛋白分别共同表达于Hi5细胞,结果显示,三种昆虫ABCC2和CAD共同表达并不能提高Hi5细胞对Cry1Ac和Cry1Ca毒素的敏感性。因此,三种灰翅夜蛾属昆虫ABCC2转运蛋白和钙黏蛋白在Hi5细胞中共同表达,对Cry1Ac和Cry1Ca毒素均没有协同作用。4三种灰翅夜蛾属昆虫对Cry1Ac敏感性差异分子机制苏云金芽孢杆菌通过与幼虫中肠刷状缘膜的蛋白受体结合,形成膜穿孔从而发挥其毒性。斜纹夜蛾和草地贪夜蛾都是灰翅夜蛾属昆虫,斜纹夜蛾对Cry1Ac毒素相对不敏感,而草地贪夜蛾对Cry1Ac毒素敏感,然而不同昆虫种群对Cry1Ac毒素的敏感性差异机制尚不明确。基于两种昆虫对Cry1Ac毒素敏感性差异,本文分析了 Cry1Ac毒素蛋白受体S1ABCC2和SfABCC2氨基酸序列,发现它们有很高的一致性。我们在Hi5细胞分别表达斜纹夜蛾SlABCC2蛋白和草地贪夜蛾SfABCC2蛋白,结果发现表达SfABCC2蛋白的细胞对Cry1Ac的敏感性是表达S1ABCC2蛋白的细胞对Cry1Ac敏感性的65.59倍。本文通过对斜纹夜蛾和草地贪夜蛾ABCC2片段替换、点突变和缺失,证实了草地贪夜蛾ABCC2转运蛋白上Q125氨基酸残基和斜纹夜蛾ABCC2转运蛋白上E125氨基酸残基是影响表达ABCC2受体的Hi5细胞对Cry1Ac敏感性差异的关键氨基酸。同样将棉铃虫上对应关键氨基酸Q122点突变,结果发现,表达HaABCC2Q122-GFP的细胞对Cry1Ac毒素的敏感性要比表达HaABCC2E122-GFP的细胞强。位于ABCC2蛋白loop1区域上的Q125或E125可能是Cry1Ac毒素的重要结合位点,这些结果表明,ABCC2上loopl区域单个氨基酸多态性是影响不同鳞翅目种群对Cry1Ac毒素敏感性差异的主要原因之一。