大鼠δ阿片受体RNA干扰质粒构建和作用分析

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目的:设计、构建并筛选靶向大鼠DELTA阿片受体(delta opioid receptor, DOR)的shRNA表达载体。方法:根据大鼠DOR mRNA序列(序列号:NM012617)设计并体外合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定。随后用脂质体2000将重组质粒转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞),48小时后测定转染效率,并分别用RT-PCR和Western Blot检测重组质粒以及阴性对照和空白对照组mRNA和蛋白表达水平。结果:酶切证明DOR-shRNA已经插入到质粒载体pGenesil-1里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准。重组质粒转染PC12细胞效率约60%,转染后48小时RT-PCR和WB结果显示,DOR3-shRNA组mRNA和蛋白表达水平明显低于空白对照和阴性对照组。结论:成功构建了3条靶向大鼠DOR的RNA干扰质粒,并且筛选出DOR3干扰质粒对大鼠DOR基因的抑制作用较强。
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