[目 的]考察中性三七多糖(NPPN)联合环磷酰胺(CTX)对荷H22肿瘤小鼠的治疗作用及痊愈小鼠再次接种H22肿瘤细胞后的免疫研究。[方 法]中性三七多糖联合环磷酰胺对荷H22肿瘤小鼠的治疗作用:构建H22实体瘤模型,考察NPPN联合CTX治疗H22肿瘤小鼠模型后的抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数、单核-巨噬细胞能力、血液指标的影响,流式细胞术检测荷H22瘤小鼠外周血中的CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B220+B淋巴细胞和CD49b+NK细胞的百分比,用双抗夹心ELISA法检测荷瘤小鼠免疫细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-y和免疫球蛋白IgG的的血清水平,苏木精—伊红(HE)染色检测治疗后肿瘤组织病理学改变,免疫组化法检测小鼠肿瘤组织中CD3+、CD4+、CD8+、CD49b+、CD19+的表达,评估NPPN对荷H22肿瘤小鼠免疫功能的影响。痊愈小鼠再次接种H22肿瘤细胞后的免疫研究:实验所获得的痊愈小鼠再次右前腋窝皮下注射H22肿瘤细胞悬液,观察接种H22肿瘤细胞后不同时间点其肿瘤生长情况,流式细胞术检测再次接种H22肿瘤细胞后不同时间点痊愈小鼠外周血液中CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B220+B淋巴细胞、CD49b+NK细胞的比例,双抗夹心ELISA法检测痊愈小鼠免疫细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-y和免疫球蛋白IgG的血清水平,HE染色观察接种部位组织形态学改变。[结 果]中性三七多糖联合环磷酰胺对荷H22肿瘤小鼠的治疗作用:NPPN+CTX对荷H22瘤小鼠肿瘤抑制率结果表明,生理盐水组小鼠平均肿瘤重量超过1g,移植瘤成功;与生理盐水组比较,各治疗组肿瘤重量均显著下降(P<0.01)。与CTX组比较,中剂量NPPN+CTX组的抑瘤率达83.23%,高剂量NPPN+CTX组抑瘤率达90.07%(P<0.05),均高于CTX组68.8%。NPPN+CTX对荷H22肿瘤小鼠脾脏和胸腺指数的影响表明,与生理盐水组比较,CTX组小鼠脾脏和胸腺指数降低,具有显著性差异(P<0.01),与CTX组比较,低、中、高剂量NPPN+CTX组脾脏指数升高,且高剂量NPPN+CTX组胸腺指数增高,有统计学差异(P<0.05)。碳廓清实验结果发现,CTX组吞噬指数α明显低于正常组。低、中、高剂量组NPPN+CTX组吞噬指数明显高于CTX组,有统计学差异(P<0.05)。血液指标检测结果发现,与生理盐水组比较,CTX组中的白细胞、淋巴细胞和网织红细胞数量显著降低(P<0.01);与CTX组比较,低、中、高剂量NPPN+CTX组的白细胞、网织红细胞数量均升高,无统计学差异,高剂量NPPN+CTX组的白细胞数升高(P<0.01)。流式细胞术检测荷瘤小鼠外周血中T、B淋巴细胞、NK细胞比例,结果表明:CTX组外周血中免疫细胞(CD3+、CD4+、CD8+、B220+)明显低于正常组,中、高剂量NPPN+CTX组与CTX组相比,CD3+水平均升高,有统计学差异(P<0.05),CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-B220+水平均升高,无统计学差异,CD3-CD49b+水平无统计学差异。双抗夹心ELISA法检测免疫细胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-y)及免疫球蛋白IgG,结果发现,与生理盐水组相比,CTX组IL-2的含量降低;与CTX组相比,中、高剂量+CTX组IL-2的含量升高,均有统计学差异(P<0.05;P<0.01)。与生理盐水组相比,CTX组TNF-α的含量降低(P<0.05);与CTX组相比,低、中、高剂量NPPN+CTX组TNF-α的含量升高,有显著性差异(P<0.01)。NPPN对荷瘤小鼠IFN-y的血清水平无明显影响。与生理盐水组相比,CTX组IgG的含量降低,有显著性差异(P<0.01),与CTX组相比,低、高剂量NPPN+CTX组IgG的含量略微升高,无统计学差异。肿瘤组织HE染色病理观察结果显示:生理盐水组肿瘤细胞生长旺盛,密度较大,坏死区域较少;与生理盐水组比较,低、中、高剂量NPPN组及CTX组肿瘤细胞数量较少,坏死区域增加;低、中、高剂量NPPN组+CTX组与CTX组比较,肿瘤组织中坏死区域更大。免疫组化结果显示:与生理盐水组比较,CTX组胞浆内棕褐色颗粒明显减少,颜色逐渐减弱,说明CD3+、CD4+、CD8+、CD49b+、CD19+表达量降低且有显著性差异(P<0.01);与CTX组比较,低、中、高剂量NPPN+CTX组胞浆内棕褐色颗粒增加,颜色逐渐增强,说明CD3+、CD8+、CD49b+、CD19+表达量增加且有显著性差异(P<0.01)。痊愈小鼠再次接种H22肿瘤细胞后的免疫研究:流式细胞术检测痊愈小鼠再次接种肿瘤后不同时间点的免疫细胞数,结果显示:与接种前1天痊愈小鼠组比较,接种后第1、4、7、14天小鼠外周血中CD49b+NK细胞均升高,且接种后第7、14天具有统计学差异(P<0.05;P<0.01);双抗夹心ELISA法检测痊愈小鼠再次接种肿瘤后不同时间点免疫细胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)和免疫球蛋白(IgG),结果显示:痊愈小鼠再次接种肿瘤后IL-2的血清水平无明显变化;与接种前1天痊愈小鼠比较,再次接种H22肿瘤细胞后不同时间点TNF-α血清水平都降低,且接种后第1、4、14天均具有显著性差异(P<0.01);与接种前1天痊愈小鼠比较,再次接种H22肿瘤细胞后第14天的痊愈小鼠IFN-γ的血清水平升高。痊愈小鼠再次接种肿瘤后IgG的血清水平无明显变化。HE染色接种部位组织形态学改变:痊愈小鼠再次接种H22肿瘤细胞后,接种前1天、接种后第1、4、7、14天,接种部位经HE染色,结果显示:痊愈小鼠接种前一天腋窝下肌肉组织无肿瘤细胞,随着接种时间的增加,接种1、4、7、14天后,接种部位肿瘤细胞仍然存在,但肿瘤不生长;至接种第200天,接种部位无肿瘤细胞。[结 论]NPPN+CTX促进CTX治疗荷H22肿瘤小鼠导致的免疫器官受损的修复,提高脾脏指数及胸腺指数;提高血液中白细胞、淋巴细胞数量;增强小鼠吞噬细胞吞噬能力,改善免疫功能;提高T淋巴细胞含量,表现为CD3+细胞比例增多,说明NPPN可增强小鼠的细胞免疫,进而达到抗肿瘤的作用;血清中IL-2、TNF-α含量提高,说明NPPN具有调节体内免疫细胞因子的分泌、提高小鼠机体免疫能力的作用;提高了 B淋巴细胞含量,表现为B220+细胞比例增多,且B淋巴细胞分泌的免疫球蛋白IgG也有所提高,提示NPPN可增强小鼠的体液免疫,进而达到抗肿瘤的作用。综上所述,NPPN从保护小鼠脾脏、胸腺机体免疫器官,提高白细胞、淋巴细胞数量,提高H22荷瘤小鼠非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫等方面明显改善小鼠免疫功能,达到抗肿瘤的目的,NPPN+CTX治疗荷H22瘤小鼠,抑瘤作用优于单独使用CTX。痊愈小鼠再次接种H22肿瘤细胞后,肿瘤不生长,但接种14天后接种部位肿瘤细胞仍然存在,CD49b+NK细胞数量均升高,提示痊愈小鼠再次接种肿瘤后肿瘤不生长可能与记忆NK细胞有关。