目的:本研究在细胞水平上观察黄芩黄连药对对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎作用,运用蛋白质组学和转录组学在RAW264.7细胞和KKAy小鼠肝组织中探讨黄芩黄连药对抗2型糖尿病的慢性炎症机制。方法:1.用1ug/mL的LPS活化巨噬细胞,诱导炎症模型。(1)采用MTT方法检测黄芩黄连药对对RAW264.7细胞活力的影响。(2)LDH试剂盒检测黄芩黄连药对对RAW264.7细胞LDH含量的影响。(3)ELISA法测巨噬细胞上清液中白介素1β(IL-1β)的相对表达量。(4)qRT-PCR检测巨噬细胞中白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达量。(5)Western blot检测巨噬细胞TLR4、MyD88蛋白的表达量。(6)细胞免疫荧光法测定巨噬细胞中NF-κB的转位情况。2.蛋白质组学分析:采用nano-LC-LTQ/Orbitrap-MS技术分析黄芩黄连药对对LPS诱导的RAW264.7细胞以及对KKAy糖尿病小鼠肝组织的影响,运用String、DAVID数据库对差异蛋白进行生物信息学分析:GO分析、KEGG Pathway富集分析、蛋白互作分析等。3.转录组学分析:采用RNA-seq法分析黄芩黄连药对对LPS诱导的RAW264.7细胞的影响,对差异基因进行GO注释功能分类、KEGG通路富集、Cytoscape网络分析,并采用实时荧光定量PCR技术对细胞中差异基因mRNA表达水平进行验证。结果:1.(1)MTT方法检测黄芩黄连药对对RAW264.7细胞活力的结果:与空白组相比,不同浓度的黄芩黄连药对含药血清对RAW 264.7细胞活力没有显著性差异(P>0.05)。(2)LDH试剂盒检测黄芩黄连药对对RAW264.7细胞LDH含量的影响:与空白组相比,不同剂量的黄芩黄连药对含药血清对RAW 264.7细胞LDH的含量没有显著性差异(P>0.05)。(3)ELISA测RAW264.7炎症模型中IL-1β的表达变化结果:与空白组比较,模型组IL-1β表达量显著增加(P<0.01);与模型组相比,黄芩黄连药对组和吡格列酮组均能降低IL-1β的表达量,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)qRT-PCR检测巨噬细胞中IL-6、TNF-α的mRNA表达量:与空白组比较,模型组TNF-α和IL-6 mRNA表达明显增加(P<0.01)。与模型组相比,黄芩黄连药对则能降低TNF-α和IL-6 mRNA的表达;在黄芩黄连药对高中低三个剂量组中,TNF-αmRNA表达下降均具有极显著性差异(P<0.01);在SC-M、SC-L组IL-6 mRNA下降均具有显著性差异(P<0.05),在SC-H组中表达无明显变化。(5)蛋白免疫印迹法(Western blot)检测巨噬细胞TLR4、MyD88蛋白的表达量:与空白组比较,模型组TLR4和MyD88蛋白表达增加极显著(P<0.01)。与模型组相比,黄芩黄连药对则能降低TLR4和MyD88蛋白的表达;在SC-H、SC-M和SC-L组MyD88蛋白表达下降均具有极显著性差异(P<0.01);在SC-L组TLR4蛋白下降具有极显著性差异(P<0.01);在SC-H组中TLR4蛋白表达有显著性差异(P<0.01)(6)细胞免疫荧光法测定巨噬细胞中NF-κB的转位情况:与空白组比较,模型组的NF-κB转位到细胞核内较多。与模型组比较,黄芩黄连药对高中低剂量和吡格列酮组均在一定程度上抑制NF-κB转位。2.细胞蛋白质组学结果显示黄芩黄连药对组与模型组差异蛋白且与空白组趋势一致的共950个差异蛋白,GO分析结果显示差异蛋白主要参与的Biological Process主要包括细胞过程、代谢过程、有机物代谢过程、生物调节、药物代谢过程、分解代谢过程等。差异蛋白主要参与的Molecular Function包括蛋白结合、催化活性、核苷酸结合、药物结合、阴离子配位等。差异蛋白主要参与的Cellular Component包括细胞质、细胞外部、细胞内、细胞器等。使用DAVID在线软件对差异蛋白进行通路富集分析,差异蛋白参与的信号通路主要包括糖酵解和糖质新生、代谢通道、MAPK信号通路、甘油脂类新陈代谢、cAMP信号通路、HIF-1HIF-1信号通路、Rap1信号通路、VEGF信号通路、甲型流感、肾细胞癌等等。运用String在线分析,输入本实验所得的黄芩黄连药对组与模型组的950个差异蛋白,得到341个有效蛋白质,其相互作用图显示差异蛋白间的相互作用复杂,众多节点蛋白与其他蛋白具有相互作用关系,部分差异蛋白呈散在的点。通过分析,筛选得到了与2型糖尿病相关的差异蛋白如CD14、Ptgs2(COX-2)、Caspase8和MAPK14等。3.肝组织蛋白质组学结果显示经过筛选得到黄芩黄连药对组与模型组差异蛋白共2412个,其中上调637个,下调1775个。使用String软件对所有差异蛋白进行GO分析,上调差异蛋白主要参与的Biological Process主要包括组织细胞组成、组织细胞器、DNA构象变化、细胞过程等。上调差异蛋白主要的Molecular Function包括ATP酶活性、核苷酸结合、小分子结合等。上调差异蛋白主要的Cellular Component包括DNA包装复合物、蛋白质-DNA复合物、细胞器部分、含蛋白复合物、染色体部分等。结果显示下调差异蛋白主要参与的Biological Process主要包括小分子代谢过程、有机酸代谢过程、药物代谢过程、细胞过程等。下调差异蛋白主要的Molecular Function包括催化活性、结合、阴离子配位、药物结合、ATP结合等。下调差异蛋白主要的Cellular Component包括细胞部分、细胞器部分、细胞骨架、髓鞘等。使用DAVID在线软件对差异蛋白进行通路富集分析,结果显示差异蛋白所参与的通路主要有代谢类通路、炎症相关信号通路及某些疾病通路。上调差异蛋白参与的信号通路包括代谢类通路如半胱氨酸和蛋氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、癌症中的中心碳代谢等,疾病通路如系统性红斑狼疮、酒精中毒、病毒致癌等。下调差异蛋白参与的信号通路主要包括代谢类通路如代谢通道、抗坏血酸和醛酸代谢、碳代谢、视黄醇代谢等,炎症相关信号通路如MAPK信号通路、AMPK信号通路等及某些疾病通路如化学致癌、药物代谢-细胞色素P450、阿尔茨海默病等。运用String在线分析,输入本实验所得的黄芩黄连药对组与模型组上调的637个差异蛋白,得到321个有效蛋白质,其差异蛋白间的相互作用部分节点蛋白与其他蛋白具有相互作用关系,众多差异蛋白呈散在的点。输入本实验所得1775个下调差异蛋白,得到864个有效蛋白质,其相互作用图显示存在众多散在的差异蛋白点,部分节点蛋白与其他蛋白具有相互作用关系,整体上差异蛋白的相互作用较为复杂。通过分析,筛选得到了与2型糖尿病相关的差异蛋白如ApoE、PIK3、AKT2、TRAF6、NF-κB等。4.转录组学结果:模型组与空白组共2816个差异基因,其中上调1864个基因,下调952个基因。模型组与黄芩黄连药对组共292个差异基因,其中上调273个基因,下调19个基因。这些差异基因经过GO富集分类得,上调差异基因被GO分类到biological process中的细胞过程、代谢过程和生物调节,分类到cellular component中的有细胞、细胞器和膜,分类到molecular function中的是结合、催化活性和分子传感器活性等。下调的差异基因被GO分类到biological process的是细胞过程、刺激应答和生物调节,分类到cellular component、molecular function中的类别与上调差异基因的GO分类类别完全一致。空白组与模型组的差异基因参与的通路有TNF信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路及乙型肝炎等。黄芩黄连药对与模型组的差异基因参与的通路主要有代谢通路、花生四烯酸代谢、药物代谢-细胞色素P450、PPAR信号通路等。使用String数据库,差异基因间形成紧密连接的网络,只有个别零散的点分布在周围。经过生物信息学分析,黄芩黄连药对与模型组的差异基因中与空白组与模型组的共同差异基因有33个,经过筛选得到22个表达上调一致和5个下调一致的基因,选取S100A8、Apoc2和Lpin1等3个基因进行qRT-PCR验证,结果为:与空白组比较,模型组S100A8 mRNA表达明显上调(P<0.01),Apoc2和Lpin1 mRNA表达明显上调(P<0.01)。与模型组相比,黄芩黄连药对则能增强S100A8 mRNA的表达,降低Apoc2和Lpin1 mRNA的表达;在SC组中,S100A8 mRNA表达具有极显著差异(P<0.01);Apoc2和Lpin1mRNA表达具有极显著差异(P<0.01);在B组中,Apoc2 mRNA表达具有极显著性差异(P<0.01),Lpin1 mRNA表达无明显变化,其变化趋势与转录组学结果一致。结论:1、黄芩黄连药对具有降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子及TLR4、MYD88蛋白表达的作用,影响NF-κB转位,提示黄芩黄连药对具有一定的抗炎作用。2、蛋白质组学研究得出黄芩黄连药对可能通过调节CD14、Ptgs2(COX-2)、Caspase8、MAPK14、ApoE、PIK3、AKT2、TRAF6和NF-κB等蛋白,参与代谢类通路、炎症相关信号通路及某些疾病通路抗2型糖尿病。3、转录组学研究得出,黄芩黄连药对可能通过调节S100A8、Apoc2、Lpin1、SGLT1、CBS等基因,参与代谢通路、花生四烯酸代谢、药物代谢-细胞色素P450、PPAR信号通路等通路在基因层面调节2型糖尿病。4、通过分析得出黄芩黄连药对可能通过TLR4/MyD88/PI3K/Akt/NF-κB信号通路,多靶点、多途径改善慢性炎症进而达到改善2型糖尿病的作用。