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研究背景胆汁淤积(Cholestasis)是一种临床常见的综合症,指肝脏合成、排泌胆汁发生障碍,胆汁成分在肝细胞中堆积,并进一步导致血液中胆汁成分含量异常升高。胆汁淤积时,一方面疏水性毒性胆汁酸在肝细胞内积聚,导致肝功能损害、肝纤维化、肝硬化、肝癌,甚至死亡;另一方面,肝细胞通过自身复杂的转录因子、核受体、膜转运蛋白、解毒酶网络,调控胆汁酸的合成、摄取、排泌、解毒等,以降低积聚的毒性胆汁酸对肝细胞的损伤,即肝脏产生适应性反应。目前对于胆汁淤积的基础研究主要聚焦于胆汁酸的合成、摄取以及排泌等方面,对于肝脏如何降低疏水性胆汁酸毒性及其分子机制尚不清楚。谷胱甘肽S—转移酶(glutathione s-transferase,GSTs)是体内重要的II相解毒酶之一,也是肝脏有效适应性反应重要执行者之一。通过催化胆汁酸谷胱甘肽化,增加其水溶性,降低毒性。GSTA超家族作为胞浆GSTs家族中重要的一员,在代谢内外源性毒性化合物中发挥着主要作用。GSTA通过催化底物(包括胆汁酸、胆红素在内的,多种内外源性毒性化合物)中的亲电子基团与谷胱甘肽(glutathione,GSH)轭合而降低底物毒性,同时增加水溶性,更易于排出细胞。同时,GSTA在抗脂质过氧化中也起着不可或缺的作用。其中,GSTA1在催化疏水性底物轭合GSH,抑制JNK信号通路介导的细胞凋亡等方面发挥重要作用;GSTA4通过自身α9螺旋处Y212残基,以氢键结合4-HNE的醛基,进而高效催化GSH与4-HNE轭合,生成GS-HE,间接发挥抗凋亡和调控分化、增殖的作用。但近期有研究报道,人阻塞性胆汁淤积时肝细胞内GSTs解毒酶表达下调。显然,这将削弱肝脏对毒性胆汁酸的处理能力,加重肝细胞损伤,甚至导致胆汁淤积治疗失败,尤其是在导致胆汁淤积的病因不能去除时。然而,目前对胆汁淤积下这些解毒酶表达下调的研究不多,涉及的分子机制仍不清楚。有研究发现,在小鼠成纤维细胞(3T3-L1 adipocytes)中,肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha TNFα)与Gsta4可能存在负相关。而现已明确,胆汁淤积时TNFα显著升高。这些研究结果提示,胆汁淤积时TNFα可能对GSTA1/A4的表达有调节作用,但目前并无研究证实并阐述机制。本研究拟从HepG2细胞和大鼠水平,探讨TNFα对GSTA1/A4表达的调节作用及分子机制。研究方法1.HepG2细胞实验1.1构建过表达钠离子-牛磺胆汁酸共转运蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的HepG2细胞。1.2分别以非结合胆汁酸,胆酸(cholic acid,CA)和鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)处理HepG2细胞;结合胆汁酸T-CA(taurine cholic acid)、G-CA(glycine cholic acid)、T-CDCA以及G-CDCA,处理过表达NTCP的HepG2细胞。用蛋白免疫印迹(Western blot)检测GSTA1/A4蛋白表达。1.3以TNFα刺激HepG2细胞,q PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction)和Western blot分别检测GSTA1/A4mRNA和蛋白表达变化。1.4 TNFα刺激HepG2细胞后,Western blot分别检测NF-κB和Nrf2蛋白水平表达。1.5 NF-κB信号通路抑制剂BAY11–7082((E)-3-[4-methylphenylsulfonyl]-2-propenenitrile)与TNFα共同处理HepG2细胞,q PCR和Western blot分别检测GSTA1/A4mRNA和蛋白的表达变化。2.动物实验将42只7-8周龄的SD(Sprague Dawley)大鼠随机分成胆道结扎(bile duct-ligated,BDL)组和假手术组(Sham组),每组各21只。Sham组动物仅接受开腹手术,并在胆总管下方放置手术线,不结扎胆总管即关腹。BDL组动物结扎胆总管后关腹。术后第3、7和14天,分别将Sham组和BDL组大鼠行安乐死,各7只/组/次,收集肝脏组织,剪成小块,提取总RNA、蛋白。利用q PCR检测Gsta2-4和Gstm1-4表达情况;免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)研究NF-κB、Nrf2与CBP(CREB—binding protein)之间的相互作用;染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)检测Nrf2与Gsta1基因启动子区域抗氧化反应元件(the antioxidant-response element—ARE)结合情况。结果1.HepG2细胞中,CA、CDCA、T-CA、T-CDCA、G-CA、G-CDCA等胆汁酸未直接下调GSTA1/A4表达。2.TNFα刺激HepG2细胞后,GSTA1/A4的mRNA水平和蛋白水平表达均明显下降,且呈剂量、时间依赖关系。3.TNFα刺激HepG2细胞后,核内p65蛋白含量及胞浆中磷酸化p65蛋白含量明显升高,提示NF-κB信号通路激活;同时,胞浆Nrf2蛋白含量无明显变化。4.BAY11–7082抑制NF-κB信号通路后,TNFα对GSTA1/A4表达的抑制作用明显减弱。5.BDL组大鼠肝脏Gsta2-4、Gstm1、Gstm2以及Gstm4的mRNA表达较Sham组显著下降。6.相对于Sham组,BDL组大鼠肝组织中NF-κB与CBP结合增多;同时,Nrf2与CBP结合减少。7.相对于Sham组,BDL组大鼠肝组织中Nrf2与Gsta1基因启动子区域ARE结合减少。结论本研究在HepG2细胞中发现,CA、CDCA、T-CA、T-CDCA、G-CA、G-CDCA等胆汁酸并未直接下调GSTA1/A4表达。TNFα以剂量、时间依赖效应,在GSTA1/A4的mRNA水平和蛋白水平抑制其表达。同时发现这种抑制作用是TNFα通过激活NF-κB信号通路介导。在进一步的动物实验中,我们发现BDL大鼠肝组织内多个Gst酶表达下调;其次,通过co-immunoprecipitation和Ch IP实验发现NF-κB与Nrf2竞争性结合CBP,导致Nrf2与Gsta1基因启动子区域ARE结合减少,从而干扰了Nrf2的转录活性。综上所述,本研究揭示了胆汁淤积时GSTA1/A4表达下调的一种可能机制,即增高的TNFα通过激活NF-κB信号通路,进而NF-κB在细胞核内竞争结合CBP,从而干扰Nrf2转录活性,导致GSTA1/A4表达下调。该调控机制的发现,不仅对于阐明胆汁淤积进展机制有重要理论意义,也为治疗胆汁淤积提供了新的思路和方向。