研究背景冠状动脉痉挛(Coronary artery spasm,CAS)是指冠状动脉心外膜血管发生痉挛收缩,导致冠状动脉管腔完全或次全闭塞,使其供血的心肌发生缺血。20世纪50年代Prizmental首次报道了变异型心绞痛,发作时心电图表现为ST段抬高,认为是自发性心绞痛,提出是由于冠状动脉痉挛所致。冠状动脉痉挛是临床缺血性心脏病的发病机制之一,可导致心绞痛发作、急性冠脉综合征发生,甚至心源性猝死,因此冠状动脉痉挛具有重要临床意义。一直以来与冠状动脉粥样硬化相比,冠状动脉痉挛无论是基础或是临床研究远远滞后,冠状动脉痉挛在我国发生率较高,但目前我国在该领域的研究很少。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是起源于骨髓的原始细胞,在一定条件下可分化为成熟的内皮细胞。根据细胞来源、形态、表面标志以及功能等方面存在显著差异,EPCs被分为两种类型,早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞(outgrowth endothelial cells,OECs)。EPCs参与出生后血管新生和血管损伤内皮的再内皮化,新生血管中约25%的内皮细胞是由EPCs分化形成的,EPCs功能障碍将影响血管新生和血管内皮修复。冠状动脉痉挛的确切发生机制尚未完全阐明,研究表明,血管内皮功能障碍在冠状动脉痉挛发生中起重要作用,EPCs在血管内皮功能的维持中发挥重要作用,目前尚无冠状动脉痉挛患者EPCs水平及功能的研究,因此有必要进行探讨。材料与方法1研究对象及分组收集2016年6月至2016年12月南通市第一人民医院门诊行冠状动脉CTA,结果提示冠状动脉主要分支狭窄<50%,但仍有反复胸痛入院患者121例。77例患者签署研究知情同意书,其中12例结合症状体征及入院后检查明确诊断为非心源性胸痛。剔除非心源性胸痛患者,65例患者行冠状动脉造影。根据冠状动脉造影结果诊断冠状动脉慢血流4例、冠状动脉主要分支狭窄在50%～70%8例。剔除上述12例患者,53例冠状动脉主要分支狭窄<50%者即行冠状动脉乙酰胆碱激发试验。根据2013日本循环学会冠脉痉挛性心绞痛诊疗指南诊断标准,30例冠状动脉乙酰胆碱激发试验阳性者设为冠状动脉痉挛组。23例冠脉乙酰胆碱激发试验阴性者行运动平板试验,20例运动平板试验阴性者设为对照组;3例运动平板试验阳性诊断为心脏X综合征,予剔除。收集同期因典型劳力性胸痛住院患者24例,行冠脉造影发现2例冠状动脉主要分支狭窄<70%,予剔除,22例至少一支冠状动脉主要分支狭窄>70%设为冠状动脉斑块组。2研究方法2.1 EPCs培养和鉴定:胸痛患者冠脉造影前抽取动脉血50 ml,以密度梯度离心法分离单个核细胞,将单个核细胞接种于人纤维连接蛋白包被的培养板,以EGM-2MV培养液培养箱培养,隔天更换培养液。将培养至第7、21天细胞进行形态学、免疫荧光、流式法鉴定。2.2 EPCs功能测定:细胞培养至第7、21天进行增殖试验、迁移试验、小管形成试验。取培养7天、21天EPCs检测NO生成水平。2.3循环EPCs水平的检测:入院次日晨取外周血流式法检测CD34+/CD45-、CD34+/CD45+、CD34+/KDR+细胞数。细胞培养至第7、21天倒置显微镜下计数EPC集落数,以评估循环EPCs水平。2.4VEGF165、SDF-1 的检测:入院次日晨取外周血,采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清VEGF165、SDF-1水平。2.5.EPCs中eNOS、P-eNOS、eNOSmRNA检测细胞培养至第7、21天以Western blot法,检测EPCs中eNOS、P-eNOS蛋白表达,RT-PCR法检测eNOS mRNA水平。2.6.血流介导的血管扩张功能(Flow-mediateddilation,FMD)检测:采用Agilent Sonos 5500彩色多普勒超声诊断仪进行肱动脉FMD检测。FMD(%)=[(D1～D0)/D0]X 100%。2.7.统计学:采用SPSS19.0统计软件,计量资料以(X±s)表示,采用独立样本t检验,计数资料以率表示,采用X2检验,相关分析采用Pearson法。p<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1 一般临床资料总共入选的胸痛患者72例,三组间相比在年龄、性别、吸烟率、空腹血糖、血肌酐、血尿素氮、高血压病、总胆固醇、甘油三酯、低密度胆固醇脂蛋白、高密度胆固醇脂蛋白水平、服用药物无差异。3.2 EPCs的培养与鉴定培养7天后细胞呈集落样生长,形态多样呈梭形、纺锤形、三角形及不规则形,21天细胞表现出鹅卵石形态,纺锤状的形状。培养7d、21d细胞膜结合FITC-UEA-I,呈绿色荧光标记,同时胞质能够吞噬Dil标记的ac-LDL,呈红色荧光标记,吞噬Dil-acLDL同时结合FITC-UEA-I,呈黄色荧光标记。流式细胞仪检测,早期集落细胞主要表达CD34、KDR、CD133,晚期集落细胞KDR表达升高,CD133表达下降。经鉴定培养7、21天细胞分别为早、晚期EPCs。3.3循环EPCs数量比较与对照组相比冠状动脉痉挛组外周血CD34+/CD45-细胞水平较低,CD34+/CD45+、CD34+/KDR+细胞数无差异;冠状动脉斑块组外周血CD34+/CD45-、CD34+/CD45+、CD34+/KDR+细胞数均低于对照组;冠状动脉痉挛组外周血CD34+/CD45+、CD34+/KDR+细胞数高于冠状动脉斑块组,同时CD34+/CD45-细胞数与冠状动脉斑块组相比无差异。冠状动脉痉挛组晚期集落数低于对照组,早期集落数与对照组无差异。冠状动脉斑块组早期和晚期集落数均低于对照组。冠状动脉痉挛组早期集落数高于冠状动脉斑块组。3.4 EPCs功能的比较冠状动脉痉挛组OECs增殖能力、成管能力低于对照组,早期EPCs增殖能力、迁移能力、OECs迁移能力与对照组无差异。冠状动脉斑块组早期EPCs和OECs增殖能力、迁移能力及成管能力均低于对照组。冠状动脉痉挛组早期EPCs增殖能力、迁移能力及OECs迁移能力、成管能力高于冠状动脉斑块组,OECs增殖能力与冠状动脉斑块组相比无差异。3.5NO合成、eNOS表达及磷酸化水平、eNOS mRNA的比较;冠状动脉痉挛组早期EPCs合成NO、eNOS表达及磷酸化(Ser1177)、eNOS mRNA水平与对照组相比无明显差异;OECs合成NO、eNOS表达及磷酸化(Ser1177)、eNOS mRNA水平明显低于对照组。冠状动脉斑块组早期EPCs、OECs合成NO、eNOS表达及磷酸化(Ser1177)、eNOS mRNA水平明显低于对照组。而冠状动脉痉挛组早期EPCs合成NO、eNOS表达及磷酸化(Ser1177)、eNOS mRNA水平明显高于冠状动脉斑块组。3.6 VEGF165、SDF-1的比较及与EPCs数量及功能的关系三组间VEGF165、SDF-1水平比较无差异,相关性分析未见VEGF165、SDF-1与EPCs数量及功能相关。3.7FMD的比较,FMD与EPCs水平及功能相关性分析冠状动脉痉挛组、冠状动脉斑块组FMD低于对照组,冠状动脉痉挛组、冠状动脉斑块组之间无差异。相关性分析显示FMD与OECs水平与功能,包括克隆数、增殖功能、NO合成、eNOS磷酸化(Ser1177)水平正相关,与OECs迁移功能、成管功能、总eNOS表达、eNOS mRNA无相关性。同时结果表明FMD与早期EPCs数量及功能无相关性,包括克隆数、增殖功能、迁移功能、NO合成、eNOS磷酸化(Ser1177)水平。结论①冠状动脉痉挛组患者OECs水平较低并有功能异常。②冠状动脉痉挛组患者OECs水平及功能与血清VEGF165、SDF-1水平无关。③冠状动脉痉挛组患者FMD明显降低,存在血管内皮功能损伤。④FMD下降与OECs水平与功能异常相关。