实验动物是现代生命科学研究的重要基础和强力支撑。随着科学技术的发展，越来越多的实验动物被应用到生命科学研究中。长久以来，益寿延年一直是人类追求的梦想，因此，衰老和寿命决定机制研究一直是生命科学领域的热点。　　目前应用于寿命研究的无脊椎动物模型主要包括秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇，脊椎动物模型主要包括小鼠和猴子。由于衰老和寿命调控机制的复杂性，模式生物在该领域研究中的利用至关重要。其中，身体构造简单而器官分化却相对完整的无脊椎实验动物受到广大研究者的青睐。至今，少数的无脊椎动物模型并不能完全满足复杂的寿命机制研究的需要，新型实验动物的开发利用十分必要。　　数千年的驯养和蚕业发展赋予了家蚕独特的生物学特点及文化内涵。长达一个世纪收集和研究积淀了丰富的突变资源，以及率先开展了基因组和功能基因组研究，为家蚕的拓展利用提供了良好的基础。同时，家蚕也具备诸多作为寿命研究的实验动物的特征，如生命周期和个体大小适中、繁殖力强、发育阶段界限清晰、外源注射所导致的物理损伤较小、寿命可塑性较强及不存在伦理问题等。有鉴于此，本研究选择家蚕作为实验动物，鉴定重要寿命基因及分析基因调控家蚕寿命的机制，为寿命决定分子机制的阐释提供新的认知。主要获得了如下研究结果：　　1.家蚕寿命与BmFoxO基因表达量间的关系　　家蚕各品系的发育时长不同，寿命也存在差异。从家蚕基因库中选取一组品系进行寿命统计，并对其中的三个代表性品系（夏芳、Dazao-N、N4）进行寿命相关基因表达模式的调查，结果显示：夏芳的平均寿命和最大寿命均较长，Dazao-N次之，N4品系的平均寿命和最大寿命较短。鉴于FoxO在多个物种中被报道是调控寿命的关键因子，我们调查了这些品系中BmFoxO在不同发育时期的表达水平，发现在蛹10天（可能决定成虫寿命的时间点），BmFoxO的表达量为夏芳显著高于Dazao-N和N4，并且N4显著低于Dazao-N。同时，在被调查的其他发育时期，BmFoxO表达趋势与相应品系的寿命也呈现出高度一致。通过控制家蚕饮食摄入量，成功构建了家蚕饮食限制实验模型；寿命统计结果表明饮食限制组寿命明显长于对照组，并且BmFoxO表达量显著高于对照组。鉴于BmFoxO的表达与寿命显著相关，所以推测该基因发挥了调控家蚕寿命的功能。　　2.家蚕Fox基因家族的鉴定与进化分析　　Fox基因编码的是一个转录因子家族，包含23个亚家族（FoxA-FoxS）。在家蚕中利用隐马尔可夫模型对Fox基因家族成员进行全基因组的分析鉴定，结果发现家蚕中含有17个Fox家族成员。通过系统发生分析，将这17个Fox家族基因归类于13个Fox亚家族。对其所属的染色体位置进行分析发现这些成员分布于13条不同的染色体上。利用相同的隐马尔可夫模型识别红带袖蝶、帝王蝶、果蝇、小鼠和人类中的Fox基因家族成员，并利用这些序列构建系统发生树，结果表明不同物种中的直系同源基因间序列高度保守。同时，对家蚕中 Fox家族基因的结构和蛋白质结构域特征分析，表明家蚕中 Fox基因大多属于单外显子基因，蛋白均包含有保守的Fork head结构域。家蚕中Fox家族基因的GO注释表明，其编码产物除未参与核孔复合体的生物合成过程外，参与了生物体内的诸多其他生物学过程。对家蚕中的Fox家族成员进行选择压力分析，结果表明Fox家族蛋白的结构域受到强烈的纯化选择。在系统发生分析中，依据参考序列对家蚕Fox基因家族中的每个成员进行了命名；同时发现FoxK亚家族在家蚕中特异性缺失。　　3.BmFoxO在调控寿命中的功能探究　　为了探索BmFoxO基因在寿命调控过程中的作用，进行了BmFoxO的干涉实验。鉴于BmFoxO在家蚕羽化1天的血淋巴中表达量较高，选择此时期的血淋巴作为BmFoxO干涉的组织，设计并合成特异的BmFoxO双链RNA干涉片段（BmFoxO-dsRNA）。由于双链干涉发挥效应需要一定时间，利用家蚕外源注射技术将BmFoxO-dsRNA通过家蚕气孔注入家蚕蛹10天的血淋巴中。结果表明，BmFoxO-dsRNA能够显著降低BmFoxO的表达水平，进而显著缩短家蚕成虫期的寿命。为了探测 BmFoxO的过表达能否延长家蚕成虫期寿命，构建了piggyBac-IE1-BmFoxO-SV40过表达载体并将其导入蛹10天家蚕血淋巴中，BmFoxO的表达水平检测发现其在注射后42h被显著上调。寿命统计结果表明，与对照组相比，过表达BmFoxO能够显著延长家蚕成虫期的平均寿命和最大寿命。利用Crispr-Cas9技术对BmFoxO进行敲除，分子检测表明G1代家蚕中BmFoxO的基因组序列确实发生了编辑。后续研究需要确定其能否对G2代家蚕的寿命产生影响。　　4.BmFoxO的靶基因筛选及其对寿命的影响　　BmFoxO表达水平的升高能够显著延长家蚕个体寿命已经得到了证实，然而其延长寿命的分子机制仍需要进一步研究。由于BmFoxO属于转录因子，其在执行功能过程中需要通过调节下游靶基因的转录活性来实现，因此FoxO下游靶基因的筛查和鉴定将为FoxO调控寿命的机制解析提供清晰的方向。构建BmFoxO组成型过表达和干涉载体，转染家蚕BmN-SWU1细胞，经抗生素筛选后，获得了较为稳定的BmFoxO组成型过表达和干涉的细胞系。免疫荧光和western实验检测发现，BmFoxO组成型过表达载体转染后表达的蛋白位于细胞核中，能够发挥调控靶基因的功能。定量检测确认组成型过表达和干涉细胞系中BmFoxO的表达水平，相比于对照组确实被上调和下调。就BmFoxO组成型过表达和干涉的细胞系取材提取RNA，进行表达谱测序。结合本小组唐冬梅对表达谱测序结果的分析所发现的符合正调控或负调控的差异表达基因共212个；我们结合果蝇FoxO靶基因的对比分析和多层筛选，最终选出家蚕和果蝇靶基因中共有的基因2个和家蚕中特有的基因5个。对筛选到的这7个基因的上游调控序列进行克隆，成功构建其中5个基因的双荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告结果显示，5个筛选到的基因均受到BmFoxO的调控，其中 BGIBMGA002356基因受到的调控最为强烈。为了探测BGIBMGA002356基因是否参与家蚕寿命的调控过程，在家蚕蛹10天对其进行了基因的双链干涉实验。结果表明干涉BGIBMGA002356基因后，其在羽化后12h的表达水平被显著下调，同时家蚕成虫期寿命被显著缩短。　　综上所述，我们证明了BmFoxO基因能够调控家蚕寿命，同时鉴定到FoxO下游的一个新的靶基因BGIBMGA002356，并通过实验证明了该靶基因受到BmFoxO的直接调控，且能够调控家蚕寿命。我们推测BGIBMGA002356可能参与了BmFoxO调控家蚕寿命的过程，这极有可能是FoxO调控寿命的一条新的路径。本研究不仅进一步丰富了我们对FoxO调控寿命机制的理解，同时也为利用家蚕作为寿命研究的实验动物提供了重要依据。