目的1.设计针对H.pylori菌种特异性及其毒力相关基因位点的引物,建立H.pylori鉴定、毒力相关基因的25重体系的多重基因分析系统。2.评估H.pylori多重基因分析系统检测幽门螺杆菌的灵敏度和特异度。3.利用H.pylori单拷贝基因ureC基因建立标准定量曲线,建立H.pylori定量分析系统。方法1.建立H.pylori鉴定、毒力相关基因的25重体系的多重基因分析系统在NCBI数据库获取25种鉴定和毒力相关基因的原始序列,利用NCBI-Primer、Primer 3.0、Premier Primer5.0三种引物设计工具针对每种基因设计多对引物。利用H.pylori标准菌株NCTC11637和悉尼SS1的DNA模版反复验证所设计引物的有效性,同时不断改变多重PCR的反应条件(主要是退火温度),最后摸索出25对引物的最佳组合以及最佳反应条件,减少引物之间的竞争,抑制非特异扩增,最终使每对引物都能够有效表达。2.评估多重基因分析系统灵敏度和特异度构建载体,建立10倍浓度梯度,拷贝数分别为10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108,针对每个拷贝数看多重基因分析系统是否有目的扩增信号来评估其灵敏度。利用大肠埃希菌标准菌株ATCC25922、铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853、乙肝病毒标准质控品、水作为阴性模版作为阴性对照体系,引物为25对上述针对H.pylori设计的引物,根据是否有扩增信号来评估该多重PCR系统的特异度。3.利用H.pylori单拷贝基因ureC基因建立标准定量曲线,建立H.pylori定量分析系统。构建载体,建立10倍浓度梯度,拷贝数分别为1、10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107和1×108,根据每个拷贝梯度所得出的目的峰面积,利用Curve expert统计软件建立拷贝数与峰面积之间的函数关系。结果1. H.pylori鉴定、毒力相关基因的25重体系的多重基因分析系统的建立通过对引物和反应条件的反复优化,最终使4对重要的鉴定基因(16SrRNA、 ureC、26KDa和ureA基因)的引物和21对毒力相关基因在同一反应体系中均得到有效表达。探索到最佳反应条件为：94℃预变性1min,94℃变性30s,60℃退火30s,70℃延伸lmin,35个循环,最后70℃延伸lmin。引物最适浓度：ureC基因的正向引物为200nmol/μL,反向引物为1μmol/μL;其余每对引物的浓度均为200nmol/μL。最佳模板浓度为10nmol～20nmol范围之间。2.多重基因分析系统灵敏度和特异度的评估对各梯度的扩增结果显示,该系统最少可以扩增出10拷贝的ureC基因,灵敏度很高；用大肠埃希菌标准菌株ATCC25922、铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853、乙肝病毒标准质控品、水作为阴性模版作为阴性对照体系时,该多重基因分析系统并没有出现任何扩增信号,表明系统高度特异。3.通过建立H.pylori标准定量曲线建立定量分析系统选取1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10梯度建立标准曲线。8个点对应的GeXP的曲线下面积分别为105032、62315、56476、47014、33849、23843、11106、7023。根据各梯度拷贝数和其所对应的GeXP曲线下面积来建立标准定量曲线。所得标准曲线的相关系数r=0.99817222>0.99,因此该标准定量曲线可以用来对H.pylori进行定量。结论1.多重基因分析系统应用于H.pylori的检测能同时检测多个基因位点的表达,可以利用多基因来确证H.pylori的感染,同时根据多重毒力相关基因的表达情况可以预测H.pylori的致病性,具有重要临床指导意义。2.该多重基因分析系统具有快速、高灵敏度和高特异度的特点,还可以对H.pylori进行定量,非常适合作为H.pylori的检测的平台。