论文部分内容阅读
在肿瘤的发生、发展过程中,肿瘤干细胞起着非常重要的作用。结直肠癌在我国是仅次于乳腺癌和肺癌、发病率位列第三的恶性肿瘤。因此,阐明结直肠癌干细胞的作用及其调控因素对于结直肠癌的临床治疗及预后判断都具有重要意义。SATB2是一种特异性的核基质结合蛋白,与SATB1同源,参与染色质重构和基因表达调控,与颅脑和骨骼的发育及干细胞分化相关。前期课题组发现,SATB2与干细胞相关基因存在相关关系,并预测到SATB2与部分干细胞相关基因启动子区域存在结合。SATB2对结直肠癌干细胞的影响及其机制仍不清楚,尚需进一步的研究。研究方法：1.SATB2干扰对结直肠癌细胞生物学特性的影响我们将包装有SATB2干扰质粒的病毒感染结直肠癌SW480细胞及DLD1细胞,运用CCK8、FN、平板克隆形成实验、Transwell小室及裸鼠皮下成瘤实验观察SATB2于扰对结直肠癌细胞系细胞生物学行为的影响。2. SATB2对结直肠癌细胞干性的影响及其机制肿瘤干细胞的特性包括肿瘤细胞的自我更新及其分化能力。我们应用条件性干细胞培养基进行肿瘤干细胞克隆球培养,观察SATB2干扰后细胞的自我更新能力的差异。通过Western Blot、免疫组织化学及细胞免疫荧光检测：SATB2干扰后细胞中干细胞标志物CD133的改变。用生物信息学软件预测SATB2与干细胞相关基因启动子区域的结合位点,应用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immune co-precipitation technology,Chip)验证SATB2与干细胞相关基因的启动子区域存在结合。3. SATB2参与miR202对Dicer调控中的作用生物信息学软件预测miR202的潜在靶标蛋白Dicer,并应用Western blot进行验证。在结直肠癌细胞中过表达SATB2,并通过QPCI检测细胞中miR202的改变。在结直肠癌细胞中过表达SATB2及与miR202模拟物共转染,用Western blot进行检测细胞中靶蛋白Dicer的改变。结果1.SATB2干扰对结直肠癌细胞生物学特性的影响FN实验结果显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的粘附能力明显增强,差异具有统计学意义(F=71.123,P=0.000)；与DLD1-NC细胞相比,DLD1-5细胞的增殖能力明显增强,差异具有统计学意义(F=39.280,P=0.000)。CCK8法结果显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的增殖能力明显增强,差异具有统计学意义(F=6.301,P=0.000),SW480-5-C2细胞的增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=25.907,P=0.000)；与DLD1-NC细胞相比,DLD1-2、DLD1-5细胞的增殖能力明显增强,差异具有统计学意义(F=3.807,P=0.000),DLD1-5-C11细胞的增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=8.774,P=0.000)。细胞平板克隆形成实验结果显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的平板克隆形成明显增强,差异具有统计学意义(F=5.832,P=0.001),SW480-5-C2细胞的平板克隆形成明显减弱,差异具有统计学意义(t=3.216,P=0.015)；与DLD1-NC细胞相比,DLD1-2、DLD1-5细胞的平板克隆形成明显增强,差异具有统计学意义(F=24.066,P=0.000),DLD1-5-C11细胞的平板克隆形成明显减弱,差异具有统计学意义(t=2.650,P=0.045)。体外运动小室实验显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义(F= 32.281,P=0.000),SW480-5-C2细胞的迁移能力明显增强差异具有统计学意义(t=3.833,P=0.004)；与DLD1-NC细胞相比,DLD1-2、DLD1-5细胞的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义(F=28.901, P=0.000), DLD1-5-C11细胞的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义(t=3.579,P=0.006)。裸鼠皮下成瘤实验显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-5-C2.SW480-5-C8细胞的皮下成瘤能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=3.480,P=0.003)；与DLD1-NC细胞相比,DLD1-5细胞的皮下成瘤能力明显增强,差异具有统计学意义(F=14.172,P=0.001)；DLD1-5-C11细胞的皮下成瘤能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=5.876,P=0.023)。2. SATB2对结直肠癌细胞干性的影响及其机制干细胞成球试验显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-5-C2、SW480-5-C8细胞的自我更新能力明显增强,差异具有统计学意义(F=5.772,P=0.040)；与DLD1-NC细胞相比,DLD1-5、DLD1-5-C11细胞的自我更新能力明显增强,差异具有统计学意义(F=6.600,P=0.031)。Western Blot结果显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-5、SW480-5-C2、SW480-5-C8细胞中CD133的表达明显增强；与DLD1-NC细胞相比,DLD1-5、DLD1-5-C11细胞中CD133的表达明显增强。细胞免疫荧光显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-5细胞中CD133的表达明显增强；与DLD1-NC细胞相比,DLD1-5细胞中CD133的表达明显增强。免疫组织化学显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-5-C2、SW480-5-C8细胞中CD133的表达明显增强；与DLD1-NC细胞相比,DLD1-5、DLD1-5-C11细胞中CD133的表达明显增强。染色质免疫共沉淀实验显示,SATB2与干细胞相关基因CD 133、CD44、 Dicer、Meis、Axin2、PRL-1启动子区域存在结合。3. SATB2参与miR202对Dicer调控中的作用结直肠癌细胞中转染miR202的模拟物及抑制剂后,Western Blot结果显示在SW480、SW620、HCT116、DLD1细胞中miR202上调后Dicer表达水平较对照组低,miR202下调后Dicer表达水平较对照组改变不明显。结直肠癌细胞中过表达SATB2后,QPCR结果显示,与SW480-Blank相比,SW480-SATB2细胞中miR202的表达水平增强,差异有统计学意义(t=3.301,P=0.021)；与SW620-Blank相比,SW620-SATB2细胞中miR202的表达水平增强,差异有统计学意义(t=3.201,P=0.015)；与HCT116-Blank相比,HCT116-SATB2细胞中miR202的表达水平增强,差异有统计学意义(t=3.371,P=0.012)；与DLD1-Blank相比,DLD1-SATB2细胞中miR202的表达水平增强,差异有统计学意义(t=2.658,P=0.045)。在结直肠癌细胞中过表达SATB2的基础上同时转染miR202的模拟物后,Western Blot结果显示在共转染后SW480、HCT116、DLD1细胞中Dicer表达水平进一步下降。结论：1.SATB2干扰与结直肠癌细胞侵袭能力呈现正向相关性。SATB2及SATB1的表达水平共同调控结直肠癌细胞体外增殖、克隆形成、体内成瘤能力。2.SATB2干扰后引起结直肠癌细胞干性增强,并使细胞中CD133表达增强。SATB2过表达引起细胞中CD133表达的减弱。SATB2可与CD133、CD44、Dicer、 MEIS、Axin2、PRL-1的启动子区域结合来调控它们的表达。3.SATB2及miR202均可引起结直肠癌细胞中Dicer表达水平的下降,SATB2通过调节miR202的水平实现对Dicer的调控。