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背景和目的:早在二十世纪末肺癌就已成为全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤,进入本世纪仍快速上升。在我国肺癌的发病率和死亡率也居各种恶性肿瘤之首,并且由于人口老龄化及环境等诸多因素,未来仍可能呈上升趋势。肺癌由于起病隐匿导致早期诊断率低,多数病例确诊即丧失了手术机会,故临床治疗常采用以化疗为主的综合治疗模式。肺癌对化疗药物耐药成为治疗失败的主要原因。肿瘤干细胞学说认为:在恶性肿瘤组织中存在极少量的具有干细胞特性的肿瘤细胞,这些细胞具有高增殖和分化以及对多种药物高度耐受的干细胞生物学特性,这种细胞被称为肿瘤干细胞cancer stem cells(CSCs)。肿瘤干细胞学说很好地从恶性肿瘤的发生、发展等层面解释了恶性肿瘤的产生和治疗失败的原因:CSCs一般处于静止期,且高表达以ABC转运蛋白为代表的耐药蛋白,故对化疗药物具有很强的耐药性,因此化疗无法将其清除,CSCs具有在一定条件下高增殖和分化的能力,使其成为肿瘤化疗后复发的来源。CSCs耐药的机制存在一个错综复杂的调控网络,故应用具有多途径、多靶点作用的中药复方制剂治疗肺癌往往会收到比较满意的效果。益肺解毒方是一临床经验总结方,具有益气养阴、解毒散结的功效,既往研究证实对顺铂有协同增效的作用,在此基础上,本研究了益肺解毒方对A549腺癌干细胞耐药性的影响。本研究首先应用无血清培养法,从肺腺癌A549细胞株中分离培养得到肿瘤球细胞,再对其进行CSCs特有的生物学特性鉴定,证实了 A549球细胞是富含CSCs的细胞群体。并进一步研究了益肺解毒方以及协同顺铂对A549球细胞增殖的影响,益肺解毒方对A549球细胞ABC转运蛋白表达的影响,为中医药治疗恶性肿瘤提供了理论、实验依据,提高了中医药在恶性肿瘤综合治疗中的地位。方法:1.无血清悬浮培养法分离、富集A549肿瘤球细胞,观察A549细胞球的形态。2.流式细胞术对A549细胞及A549球细胞进行细胞周期、凋亡、CD133表达的检测。3.CCK8细胞增殖实验对A549细胞及A549球细胞进行细胞增殖的检测。4.裸鼠成瘤实验对A549细胞及A549球细胞进行体内成瘤能力的检测。5.CCK8细胞毒性实验对A549细胞及A549球细胞进行对顺铂的耐药性的检测。6.CCK8细胞毒性实验检测益肺解毒方含药血清及顺铂对A549球细胞细胞增殖的影响。7.流式细胞术对经益肺解毒方处理的A549球细胞和未处理的细胞进行耐药相关蛋白ABCB1和ABCG2表达的检测。结果:1.无血清悬浮培养可以得到A549肿瘤球细胞。2.流式细胞术发现,相对于A549细胞,A549球细胞多数处于G0/G1期,P<0.001细胞凋亡率明显降低,P<0.001;CD133+表达比例明显增高,P<0.05。3.CCK8细胞增殖实验发现,A549球细胞增殖能力明显强于A549细胞,P<0.001。4.裸鼠成瘤实验发现,A549球细胞最少需5×103个即可形成移植肿瘤,而A549细胞则最少需要1×105个。5.CCK8细胞毒性实验发现,顺铂对A549球细胞的48小时IC50值明显高于对A549细胞,P<0.05。6.CCK8细胞毒性实验发现,高剂量益肺解毒方含药血清和顺铂及高剂量益肺解毒方含药血清联合顺铂对A549球细胞增殖均有抑制作用,高剂量益肺解毒方含药血清联合顺铂作用明显强于单独应用顺铂,并二者具有协同增效作用,q>1.15。7.流式细胞术发现,经益肺解毒方作用过的A549球细胞相对于未作用的球细胞ABCB1和ABCG2的表达均明显降低,P<0.05。结论:1.印证了应用无血清悬浮培养法可以分离得到富含A549肿瘤干细胞的A549球细胞。2.益肺解毒方对肺腺癌A549肿瘤干细胞增殖具有明显的抑制作用,益肺解毒方联合顺铂对肺腺癌A549肿瘤干细胞增殖抑制具有协同增效作用。3.益肺解毒方联合顺铂对肺腺癌A549肿瘤干细胞增殖抑制具有协同增效作用,其机制之一,可能是益肺解毒方下调了肺腺癌A549肿瘤干细胞耐药相关ABC蛋白的表达。