论文部分内容阅读
α-羟基苯乙酸(HPA)是极其重要的手性药物中间体。目前,单一构型HPA的制备主要采用化学合成或外消旋体手性拆分。而国际上刚刚兴起的生物转化以其温和的反应条件和近乎绝对的光学选择性,已成为当今手性药物研究的重点和热点。本文以潜手性化合物苯乙酮酸(PGA)为前体,利用完整细胞不对称合成(R)/(S)-HPA。从5个种属38种微生物中筛选出对HPA具有较高转化活性,能不对称合成R-HPA的菌株Se10及能不对称合成S-HPA的菌株Lk5。以Sc10及Lk5为出发菌株,通过诱变,驯化,混合培养及生物转化条件优化等手段,有效地提高生物转化效率。利用紫外与微波辐射对Sc10进行诱变,筛选到R-HPA高产菌株Sc10.9.48,其底物耐受由10mmol/L提高到60mmol/L.通过对生物转化条件进行优化,在摇床转速140rmp,温度34℃,pH 6.5,初始底物浓度为60mmol/L的条件下,生物转化54h后高效液相色谱表明HPA得率为81.5%,毛细管电泳表明R-HPA的对映体过量值(e.e.)高达99.4%,质谱结果表明产物分子量151,是所制备的HPA。通过对菌株Lk5进行驯化得到S-HPA高产菌株Lk5.1,可耐受底物浓度由10mmol/L。提高到40mmol/L。利用单因素实验与正交实验相结合的方法优化MRS培养基中的碳源与氮源。结果表明,不同碳氮组合对生物转化具有一定的影响。在葡萄糖1%、蛋白胨O.5%、酵母浸膏1%,柠檬酸氢二铵O.1%配比情况下,生物转化48h后S-HPA得率及e.e.分别为80.7%,99.7%。利用双菌组合体系(Sc10.9.48和Lk5.1)不对称合成R-HPA,其e.e.达99.4%,可耐受底物浓度及转化速率均高于纯Sc10.9.48转化体系。通过细胞破碎、硫酸铵沉淀及DEAE-sepharose离子交换层析对(R)/(S)-HPA脱氢酶进行了纯化。纯化倍数分别为25.4及19.8倍,酶活回收率为42.1%及40.0%。