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双微体(DMs)是细胞中环状成对、可自主复制的额外染色体成分，经常含有扩增的基因，参与细胞增殖，或为细胞生长提供选择优势。由于DMs没有中心粒和端粒，其复制、分离的详细机制目前还不十分明了。而且DMs形成早期的模型很难得到，目前对其产生的机制仍有相当大的推测成分。本实验用3T3R500回复系细胞经氨甲蝶呤(MTX)药物筛选可获得耐受100μmol/L和300μmol/LMTX的细胞群体(MTX100和MTX300)。将耐药细胞与3T3R500回复系细胞在细胞培养、DMs的数量及细胞周期等方面进行比较。
结果:耐药细胞对培养条件要求较高；DMs的数目随着耐药量的增加而增加，并在冻存复苏后两周左右达到稳定；耐药细胞的细胞周期中S期时间明显延长。采用二次胸苷同步化法使MTX100细胞同步于G1/S期交界，再释放至S期早、中、晚3个时相及G1期、G2/M期，通过提前凝集染色体技术(PCCs)得到不同时间段的提前凝集染色体，在光学显微镜下观察DMs复制的具体情况。结果发现DMs在G1期为单体；S早期多数为双体，仅少量为单体；S中期双体多于早期；至S晚期基本都为双体；G2/M期为双体。因此我们认为DMs的复制贯穿整个S期，但在S早期达到复制高峰。同时，用绿色荧光蛋白(GFP)标记核小体成分组蛋白H2B，构建H2B-GFP真核表达载体，转染UACC-1598细胞，运用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)根据荧光信号成像，通过CLSM软件的分析检测荧光物质的特征，初步识别DMs，可以反映活体细胞状态下DMs存在的情况，为CLSM观测DMs的形成、复制分离规律打下良好的基础。