目的通过建立微生态系统研究水体氮磷富营养化对水源性肠球菌抗生素(氨苄西林、头孢唑林、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星、四环素和氯霉素)耐药性所产生的影响,同时研究该条件对肠球菌生物膜生成能力及其细胞黏附力所产生的影响。通过研究该条件对肠球菌fsr调控系统及其sprE、gelE基因表达所形成的影响;并且分析肠球菌fsr调控系统及其sprE、gelE基因与该菌耐药性及生物膜之间的联系。最后,得出氮磷富营养化条件下水源性肠球菌生物膜形成与fsr系统及gelE、sprE基因的关系。方法将本试验系统分为四个剂量组并各设立两个重复,分别设立Omg/L、1.50mg/L、4.50mg/L、12.50mg/L 四个氮剂量组及 Omg/L、0.15mg/L、0.15mg/L、1.25 mg/L四个磷剂量组(同时对比在0.15mg/L氮剂量中不同磷剂量下的区别)。以第Od、1d、7d、14d、21d、28d、40d、60d、95d为采样时间进行采样并分离菌株。对分离到的菌株分别检测其氨苄西林、土霉素、红霉素、庆大霉素、环丙沙星、四环素和氯霉素的耐药情况;使用结晶紫染色法检测所分离菌株的生物膜生成能力及使用半定量法检测其细胞黏附力大小;最后通过荧光定量PCR探索氮磷对本系统所得菌株的fsr调控系统及其下游gelE、sprE基因表达产生的影响。在系统前期通过水样检测确定本系统中总氮(TN)、总(TP)磷的基底值。分别在采样前/后一天检测系统水样中的TN、TP浓度及高锰酸盐指数(CODMn)并横向跟踪其动态变化。根据CLSI推荐的微量肉汤稀释法分别检测肠球菌就对7种不同抗生素的耐药情况;通过结晶紫染色法研究菌株生物膜的形成能力及使用半定量法检测相应菌株的细胞黏附力大小。利用实时荧光定量PCR 了解在氮磷水体富营养化中肠球菌fsr调控系统及其下游gelE、sprE基因的表达情况。最后,通过组内纵向及组间横向分析水体氮磷富营养化对肠球菌fsr调控系统及其下游gelE、sprE基因表达所形成的影响。结果1在确定系统氮磷基底值后,通过加入相应的氮磷营养盐使系统水体达到各剂量组预期总氮总磷水平。对水样的检测发现各剂量组均得到明显的总氮浓度差异及较明显的总磷浓度差异。药敏试验结果显示:对照组中未出现耐药菌株;在低剂量组中后期出现低水平红霉素、土霉素耐药,耐药率为25%;中剂量组从中期开始出现达68.8%的土霉素高耐药水平,随着系统进入试验后期该数值达到了75%并伴随着低水平红霉素耐药的出现;在高剂量组中出现了高达25%的红霉素耐药及100%的土霉素耐药。通过多重耐药性对比可知:高剂量组出现肠球菌对红霉素和土霉素两种抗生素耐药;但在低剂量组中出现肠球菌对氨苄西林、红霉素、土霉素和氯霉素多重耐药。2本系统各剂量组中,氮磷对肠球菌生物膜形成的影响各不相同。其中以中剂量组效果最为明显,持续时间最长;生物膜形成效果高剂量组次之,但是低剂量组形成生物膜的持续时间略短于中剂量组,比高剂量组持续较长。对比各剂量组肠球菌细胞粘附力大小可知:中/高剂量组具有明显高粘附力,具有持续时间长等特点;而中剂量组的细胞粘附力显著强于高剂量组。结合肠球菌生物膜与细胞粘附力结果可知:本系统中分离得到的肠球菌生物膜形成能力与其细胞粘附力成正比。3经过对本实验所有采集菌株进行荧光定量PCR检测后发现:在本系统自然条件下fsrA基因及gelE具有自我表达能力;低剂量氮磷可以明显抑制gelE基因表达量,并且可以延迟fsrA表达峰值的出现;中剂量组和高剂量氮磷可以极大诱导肠球菌fsrA和gelE基因的表达量,但是中剂量组的诱导效果最佳可达上万倍的相对表达量的出现并尚未在本试验观察时间内出现峰值;高剂量氮磷在刺激肠球菌短时间内出现上万倍的相对表达量后,菌株的gelE表达水平又重新落回并稳定在偏低水平。4根据本实验结果我们认为:氮磷营养盐可以对肠球菌fsr系统及下游sprE、gelE基因表达产生有效的影响。同时,因为在本系统水体中氮的组间浓度差异比磷更加清晰明显,因此我们认为氮对肠球菌fsrA及gelE基因表达的影响为主要作用。结论1中剂量氮磷浓度可以最有效地诱导肠球菌形成抗生素耐药,持续时间最长并出现多重耐药现象,高剂量次之;2氮磷营养盐条件下分离到较强耐药性或多重耐药的肠球菌株都具有更强的生物膜形成能力。中剂量组的诱导形成生物膜最为明显且持续时间最长,而高剂量组次之;此外,肠球菌生长在自然条件下也会逐渐产生较弱的生物膜现象。肠球菌的细胞粘附力大小与其生物膜形成能力成正相关。3低剂量氮磷浓度可延迟肠球菌fsrA基因的表达,中剂量氮磷可极大地抑制fsrA基因的表达量;高剂量氮磷对fsrA基因表达的抑制作用则更强。低剂量氮磷可推迟肠球菌gelE基因表达峰值的出现时间;而中剂量氮磷却极大地增强gelE基因的表达使其呈对数式增长,并且在本实验时间尚未出现其表达峰值;而高氮磷剂量却可以诱导肠球菌出现短暂的gelE表达高峰期。4氮磷营养盐可以诱使肠球菌出现基因选择性表达,并因fsrA基因的抑制及gelE基因表达增强直接导致细菌生物膜形成能力与细胞粘附力的增强;而这些结果都直接促使肠球菌耐药性增强及多重耐药性的出现。