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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease）是最主要的神经退行性疾病,其主要的病理学特征为Aβ斑块聚集形成的老年斑、Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结（NFTs）、弥漫性皮质脑萎缩等。钙失调假说是近期提出的针对AD发病前期胞内钙离子紊乱机制的猜想,细胞内钙离子浓度远低于细胞外,且钙离子多储存于内质网中,主要由内质网上三磷酸肌醇受体（IP3R）调控,而在最近的研究中,研究者们发现在AD模型小鼠中,众多因素导致细胞内钙离子处于高水平状态,例如长期慢性的神经炎症引起的胶质细胞中IP3R的过度开放。本课题组之前的研究也表明:在细胞水平给予IP3R阻断剂Xestospongin C（Xe C）可以有效拮抗Aβ1-42引发的神经毒性增强,改善细胞内钙超载和早期凋亡情况的发生;同时“三重组分突触结构”概念的提出让我们关注到星形胶质细胞对于突触功能的重要作用,星形胶质细胞释放神经调质作用于突触,调节突触功能,所以我们猜想星形胶质细胞内钙稳态在AD发病进程中有重要作用。为了证实这一假设,本研究选取星形胶质细胞胞内钙紊乱为切入点,下调内质网钙离子通道受体IP3R,使星形胶质细胞胞内钙离子水平下降,在细胞水平观察收到刺激后胞内钙振荡的幅度,并包被病毒,进行海马内注射,在动物水平观察AAV-IP3R对APP/PS1模型小鼠认知行为的改善作用,然后检测突触相关蛋白SYP和PSD-95的表达水平,观察海马神经元突触形态可塑性变化,探究星形胶质细胞IP3受体在AD模型中的作用。方法:1.细胞实验:筛选下调星形胶质细胞IP3R的sh RNA并转染到提前培养好的原代星形胶质细胞,检测胞内钙水平、IP3R的表达情况。然后将星形胶质细胞分为四组,分别是:wildtype5’ITR+ACSF、wildtype5’ITR+Aβ、IP3R-sh RNA+ACSF和IP3R-sh RNA+Aβ,其中第2、4组进行Aβ孵育24 h进行钙离子成像实验,观察急性给予谷氨酸刺激后引起的胞内钙升高程度。（1）原代星形胶质细胞的培养:使用SD乳鼠提取原代星形胶质细胞,差速贴壁法分离星形胶质细胞,并检测其细胞纯度。（2）构建含sh RNA的质粒并进行细胞转染:使用特异性下调星形胶质细胞内质网上IP3R的质粒转染细胞,检测其转染率,利用Western blot技术检测其下调内质网IP3R的水平。（3）检测下调IP3R后星形胶质细胞内质网中钙离子的变化:使用特异性内质网钙离子指示剂Mag-Fluo-AM孵育细胞,观察下调IP3R后星形胶质细胞受到刺激后的内质网钙离子变化。2.在体实验:将筛选好的sh RNA包被AAV-9病毒并进行立体定向注射到小鼠海马CA1区,以此为依据将8月龄APP/PS1转基因小鼠及其野生型同窝对照小鼠分为四组:WT+AAV-IP3R,WT+AAV-Con,APP/PS1+AAV-IP3R和APP/PS1+AAV-Con,每组12只,海马内注射结束后继续饲养,恢复观察一个月,观察其认知行为的改善。行为学实验后,检测海马组织匀浆中突触相关蛋白和神经递质的水平,最后取脑切片观察突触结构可塑性的变化。（1）海马立体定向注射:将小鼠固定于立体定位仪,消毒后剪开头皮,找到前囟点,在后移2 cm旁开1.5 cm处钻孔,颅骨下1.8 mm处注射AAV-IP3R及其对照病毒,而后缓慢退针、缝合创口,饲养并恢复4周。（2）旷场试验:将小鼠放入旷场中,记录8 min内的活动轨迹,观察其运动总距离和中央区域停留时间百分比。（3）新物体识别实验:小鼠探索两个相同的物体,8 h后更换其中一个物体为颜色和形状都不同的新物体,令其探索相同的时间,记录新物体识别指数（NOI）。（4）Y迷宫实验:记录各组小鼠在8 min内的进臂次数和自发交替正确率,每第三次进臂与前两次均不同视为一次正确进臂。（5）Morris水迷宫实验:定位航行实验记录各组小鼠每天的逃避潜伏期,空间探索实验记录各组小鼠在目标象限时间百分比和穿台次数。（6）Western blot实验:行为学实验结束后麻醉小鼠,灌注取海马组织匀浆,检测突触相关蛋白含量。（7）透射电镜实验:在6000倍镜下观察各组组织中突触数量和形态。（8）高尔基染色实验:脑片切片观察海马区神经元树突数量和树突棘密度。（9）酶联免疫吸附实验:检测海马组织匀浆中Glu和GAD的表达含量。结果:（1）在细胞实验中,IP3R-sh RNA能显著降低细胞内基础钙离子浓度,在给予谷氨酸刺激后,细胞内钙离子浓度上升幅度减少,且上升速度变慢,IP3R-sh RNA组GRP78表达水平下降,表明下调IP3R能减缓Aβ引起的细胞内质网应激水平。（2）旷场实验中,下调海马区星形胶质细胞IP3R不改变APP/PS1小鼠的运动能力,且海马内注射病毒实验对小鼠的运动功能无明显影响（P＞0.05）。（3）新物体实验中,熟悉阶段四组小鼠探索两物体时间无明显差异（P＞0.05）,测试阶段APP/PS1小鼠NOI指数明显低于WT小鼠（P＜0.01）,在下调IP3R后NOI指数提升（P＜0.01）。（4）Y迷宫实验中,APP/PS1组小鼠在下调IP3R后自发交替正确率相较于AAV-Con组有明显的改善（P＜0.05）。（5）水迷宫实验中,WT+AAV-Con组相较于APP/PS1+AAV-Con组小鼠逃避潜伏期更短（P＜0.05）,IP3R下调后改善了APP/PS1小鼠的长期学习功能。APP/PS1+AAV-Con组小鼠在目标象限停留时间和穿台次数明显低于WT+AAV-Con组（P＜0.01）,表明APP/PS1转基因小鼠在目标象限的游泳时间较少,而APP/PS1+AAV-IP3R组小鼠的目标象限停留时间和穿台次数有所增加（P＜0.05）。（6）突触相关蛋白均在APP/PS1组内表达下降,下调IP3R后PSD-95和SYP在双转小鼠海马组织匀浆中的表达均表现为上升趋势（P＜0.01）。（7）透射电镜结果表明,APP/PS1+AAV-Con组单位面积内的突触数量比WT+AAV-Con组明显减少（P＜0.01）,且突触间隙宽而短,下调IP3R后可见突触形态趋向正常化,突触密度数量增加。（8）高尔基染色结果表明,APP/PS1双转小鼠神经元树突数量较少且树突分叉较少,下调IP3R后改善了50μm以内的树突分叉情况,且平均树突棘密度有所上升（P＜0.01）。（9）ELISA实验结果表明,在APP/PS1模型小鼠中GAD浓度较高,Glu表达含量较低,下调IP3R后GAD的表达下降,Glu含量增加（P＜0.01）,推测IP3R可能是通过下调GAD的表达来保证突触Glu的含量稳定。结论:本研究通过脑内注射AAV病毒下调IP3R改善了APP/PS1双转鼠认知行为,减轻了AD小鼠内质网应激反应,提高了突触相关蛋白的表达并且改善了突触形态,进一步明确了特异性下调星形胶质细胞IP3R对APP/PS1小鼠学习记忆功能和脑内突触结构功能的改善作用,从而证实以脑内三重组分突触结构中星形胶质细胞的钙稳态为靶点,将可能是早期防治AD的有效策略。