研究背景：当前，随着社会经济的发展及人民生活水平的提高，糖尿病(DiabetesMellitus)已成为威胁人类生命健康的最重要疾病之一。最新的流行病学调查显示，我国20岁以上糖尿病患者人数已达9240万，是全世界糖尿病患者人数最多的国家。糖尿病的主要损害在于其引起的各种器官并发症，以心脏并发症的危害最重，是糖尿病患者死亡的主要原因。对糖尿病心脏损伤的机理已有大量研究，但仍主要集中在冠脉血管损伤以及炎症反应的影响，而高糖高脂等对心肌细胞直接损伤的研究仍然较少。硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)系统是体内重要的氧化还原蛋白系统，广泛表达于各种细胞，具有抗自由基损伤、抗凋亡和促进细胞生长的功能，在很多有自由基大量生成的疾病如缺血再灌注损伤等的发生、发展中均发挥了重要作用。2009年和2010年我实验室在髙糖高脂诱导结合STZ注射制成的2型糖尿病大鼠在体模型和高糖高脂刺激培养的成年大鼠心肌细胞的离体模型上都观察到明显的心肌细胞凋亡发生，同时伴有Trx活性的下降。在分析Trx活性下降的原因时，我们注意到糖尿病时内源性的Trx相关蛋白(TrxinteractingProtein,TXNIP)表达升高显著。TXNIP是Trx的内源性抑制蛋白，能与Trx结合而妨碍其功能。在糖尿病心肌损伤中TXNIP的表达显著上调，提示TXNIP在糖尿病心肌细胞的损伤发生中起了重要的作用。目的：1.以高糖、高脂刺激模拟糖尿病诱导心肌细胞损伤，给予外源性Trx补充，提高Trx活性，观察是否可以减轻心肌细胞的损伤，以确认Trx在高糖、高脂引起的细胞损伤中的作用。2.以高糖、高脂刺激模拟糖尿病诱导心肌细胞损伤，使用RNA干扰技术抑制心肌细胞内源性TXNIP的表达，观察是否可以提高心肌Trx功能从而减轻高糖高脂刺激引起的心肌细胞凋亡。方法：1给予外源性Trx干预将处于对数生长期的H9c2心肌细胞随机分为3组：正常对照组（普通DMEM培养基葡萄糖5mmo1/L加入20mmo1/L甘露醇）、高糖高脂组（DMEM高糖25mmo1/L培养基加入高脂600μmol/L软脂酸）、Trx干预组（在高糖高脂组的培养基中加入3μmol/LTrx）。培养48h后，分别收集培养基上清与细胞，测定LDH、caspase-3及Trx活性，并用westernblot方法测定Trx的蛋白表达。2验证重组质粒的抑制效果将处于对数生长期的H9c2细胞随机分成五组：正常对照组（即未转染的正常细胞），阴性对照组（即RNAi-HK组：转染阴性对照质粒RNAi-HK的细胞），RNAi-TXNIP1组（转染质粒RNAi-TXNIP1的细胞），RNAi-TXNIP2组（转染质粒RNAi-TXNIP2的细胞），RNAi-TXNIP3组（转染质粒RNAi-TXNIP3的细胞）。说明：我们首先用质粒RNAi-HK转染细胞，在24h、48h、72h荧光显微镜下观察并计算转染效率，从而寻找转染效率最高的时间。按照此时间对5组细胞进行相应转染操作和培养，在转染效率最高的时间收集细胞用RT-PCR及Westernblot方法检测TXNIP的表达，分析RNA干扰效果。3分析TXNIP在高糖高脂诱导心肌细胞凋亡的作用通过前一部分实验，我们筛选到对TXNIP抑制效率最高的RNAi-TXNIP3重组质粒用于本部分实验。实验分为4组，将转染对照质粒RNAi-HK的H9c2细胞随机分成两组：正常+RNAi-HK组（使用含葡萄糖5mmo1/L的DMEM培养基加入甘露醇20mmo1/L作为对照培养基），高糖高脂+RNAi-HK组（使用含葡萄糖25mmo1/L、软脂酸600μmol/L的DMEM培养基作为该组培养基)；将转染RNAi-TXNIP3的H9c2细胞随机分成两组：正常+RNAi-TXNIP3组(培养基同正常+RNAi-HK组)；高糖高脂+RNAi-TXNIP3组(培养基同高糖高脂+RNAi-HK组)，四组均于培养48h后收集培养基上清和细胞，测定TXNIP表达、LDH、caspase-3、Trx及p38激酶活性。结果：1外源性给予Trx干预结果1.1乳酸脱氢酶活性的变化与正常组比，高糖高脂组的乳酸脱氢酶活性显著增高(260.50±11.35vs.69.20±8.04,P<0.01)，提示高糖、高脂可引起心肌细胞损伤；而Trx干预组，乳酸脱氢酶活性下降(90.63±6.03vs.260.50±11.35,P<0.01)，表明外源给予Trx能显著减少高糖、高脂的刺激对心肌细胞的损伤（见图1）。1.2心肌细胞凋亡检测本实验通过caspase-3活性测定来检测心肌细胞凋亡程度。caspase-3是caspase依赖性凋亡的最终共同途径，通过特异性的裂解下游多聚ADP-核糖聚合酶PARP，激活Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶而导致细胞凋亡，故可以通过测定其活性来反映细胞凋亡的程度。结果表明，与正常组比，高糖、高脂的刺激可引起H9c2心肌细胞caspase-3活性显著升高(1.68±0.04vs.0.67±0.09,P<0.01)，而Trx干预可显著减轻高糖、高脂的刺激引起的心肌细胞凋亡(caspase-3活性0.87±0.05vs.1.68±0.04,P<0.01)（见图2）。1.3H9c2细胞Trx活性测定用胰岛素还原法检测H9c2心肌细胞Trx活性。与正常对照组比，高糖高脂组Trx的活性显著下降(0.28±0.048vs.1.008±0.10,P<0.01)，而与高糖高脂组比，Trx干预组Trx活性显著提高(0.87±0.127vs.0.28±0.04,P<0.01)（见图3）。1.4Westernblot检测Trx蛋白的表达由Westernblot显色及条带分析结果可见，与正常组比，高糖高脂组Trx表达未见明显变化(1.07±0.07vs.1.06±0.07,P>0.05)（见图4），说明高糖、高脂的刺激未引起Trx蛋白量的改变。Trx干预组因加入大量外源性Trx蛋白，其Westernblot检测无明显价值，故未做分析。2验证重组质粒的抑制效果的实验结果2.1荧光显微镜观察转染效率我们先用阴性对照组的重组质粒RNAi-HK转染细胞，分别在24h、48h、72h不同时间点用荧光显微镜观察H9c2细胞的转染效率。结果可见三组H9c2细胞胞浆内均有GFP呈现的绿色荧光，表明有细胞转染成功。通过计算绿色荧光细胞数占总细胞数百分比，发现转染H9c2细胞24h、48h、72h后的转染效率分别为10.94±1.02%、81.86±5.43%、48.30±5.67%，可以看出转染48h的转染效率显著高于转染24h(P<0.01)和转染72h(P<0.01)（见图8），故我们选择此时间点用于后续瞬时转染靶基因表达抑制率的分析。2.2检测转染重组质粒后对TXNIP的干扰效果2.2.1RNAi对TXNIPmRNA表达影响与正常组比，H9c2心肌细胞TXNIPmRNA相对表达量在RNAi-HK组无显著变化(0.92±0.05vs.1.025±0.025,P>0.05)，在RNAi-TXNIP1、RNAi-TXNIP2和RNAi-TXNIP3组TXNIP的mRNA水平显著下降，分别为0.34±0.02vs.1.02±0.02(P<0.01)、0.62±0.082vs.1.02±0.02(P<0.01)和0.24±0.05vs.1.02±0.02(P<0.01)（见图11），表明构建的3个重组质粒均能降低TXNIPmRNA的表达，抑制率分别为66%、38%和76%，其中以RNAi-TXNIP3组抑制效率最高。2.2.2RNAi对TXNIP蛋白表达影响与正常组比，H9c2心肌细胞TXNIP蛋白相对表达量在RNAi-HK组无显著变化(0.84±0.04vs.0.92±0.02,P>0.05)，在RNAi-TXNIP1、RNAi-TXNIP2和RNAi-TXNIP3组显著下降，分别是0.44±0.03vs.0.92±0.02(P<0.01)、0.68±0.06vs.0.92±0.02,(P<0.01)和0.26±0.01vs.0.92±0.02,(P<0.01)（见图12）。以上结果显示，三条干扰片段均能干扰TXNIP蛋白表达，抑制率分别为56%、32%和74%。综合RT-PCR和westernblot结果分析，重组质粒RNAi-TXNIP3对H9c2细胞TXNIP基因的沉默效果最为明显。故我们选用重组质粒RNAi-TXNIP3完成后续实验。3运用TXNIP干扰质粒分析TXNIP在高糖高脂诱导心肌细胞凋亡的作用3.1TXNIP表达的测定3.1.1TXNIPmRNA表达改变与正常+RNAi-HK组比，高糖高脂+RNAi-HK组TXNIPmRNA表达显著增加(1.40±0.03vs.1.0±0.06,P<0.01)，而正常+RNAi-TXNIP3组TXNIPmRNA表达显著降低(0.24±0.15vs.1.0±0.06,P<0.01)，与高糖高脂+RNAi-HK组比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3组TXNIPmRNA表达显著降低(0.47±0.04vs.1.40±0.03,P<0.01)（见图14）。3.1.2TXNIP蛋白表达改变与正常+RNAi-HK组比，高糖高脂+RNAi-HK组TXNIP蛋白表达显著增加(1.80±0.05vs.0.92±0.05,P<0.01)，而正常+RNAi-TXNIP3组TXNIP蛋白表达显著降低(0.26±0.04vs.0.92±0.05,P<0.01)；与高糖高脂+RNAi-HK组比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3组TXNIP蛋白表达显著降低(0.30±0.04vs.0.92±0.05,P<0.01)（见图15）。以上结果说明高糖高脂刺激诱导心肌细胞TXNIP表达显著增加，给予RNA干扰后明显抑制了TXNIP的固有表达，并且可以显著抑制高糖高脂刺激引起的TXNIP表达。3.2乳酸脱氢酶活性测定与正常+RNAi-HK组比，H9c2心肌细胞乳酸脱氢酶活性在高糖高脂+RNAi-HK组显著增高(260.50±11.35vs.69.20±8.04,P<0.01)；与高糖高脂+RNAi-HK组比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3组显著降低(106.90±13.16vs.260.50±11.35,P<0.01)（见图16）。这表明抑制TXNIP表达能减少高糖高脂刺激引起心肌细胞损伤。3.3caspase-3活性分析与正常+RNAi-HK组比，H9c2心肌细胞caspase-3活性在高糖高脂+RNAi-HK组显著增高(1.68±0.04vs.0.68±0.09P<0.01)；与高糖高脂+RNAi-HK组比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3组显著降低(1.03±0.08vs.1.68±0.04;P<0.01（)见图17）。这表明抑制TXNIP表达能减少高糖高脂刺激引起心肌细胞凋亡。3.4Trx活性分析与正常+RNAi-HK组比，H9c2心肌细胞Trx活性在高糖高脂+RNAi-HK组显著降低(0.28±0.04vs.1.00±0.09,P<0.01)；与高糖高脂+RNAi-HK组比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3组Trx活性显著升高(0.44±0.12vs.0.28±0.04;P<0.05)（见图18），提示抑制TXNIP的表达可以减轻高糖高脂刺激时Trx活性的抑制，也证明髙糖高脂时TXNIP是通过抑制Trx活性诱导心肌细胞损伤和凋亡的。3.5p38激酶活性分析与正常+RNAi-HK组比，H9c2心肌细胞p38激酶活性在高糖高脂+RNAi-HK组显著增高(1.86±0.09vs.1.05±0.09,P<0.01)；与高糖高脂+RNAi-HK组比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3组显著降低了髙糖高脂刺激引起的细胞p38激酶活性的升高(1.24±0.16vs.1.86±0.09;P<0.01)（见图19）。已有研究证明Trx可以抑制ASK1活性，而p38激酶位于ASK1的下游，p38激酶活化后可激活caspase-3而引起细胞凋亡，因而我们推测TXNIP是通过抑制Trx的功能而促进ASK1的活化，进而通过p38激酶引起凋亡的。结论1.高糖、高脂刺激可以引起H9c2心肌细胞损伤和凋亡，其机制与高糖高脂引起细胞Trx活性的降低有关，补充外源性Trx可明显提高Trx的活性，减轻心肌细胞的损伤和凋亡。2.高糖高脂对Trx的活性抑制作用与其诱导TXNIP的表达有关。使用RNA干扰质粒抑制高糖高脂刺激引起的TXNIP表达，能够提高Trx活性，减少p38激酶的活化，进而减轻心肌细胞的凋亡和损伤。