自发性脑出血患者在脑卒中患者中占10-15%,具有高发病率和高死亡率的特点。在中国,死于脑出血的患者占所有脑血管疾病致死患者的61.7%,约40%的患者在发病1个月内死亡,是中国住院患者死亡的主要原因之一。尽管,关于脑出血疾病的病理生理机制研究已经取得了巨大的进步,但是仍然缺乏有效的治疗手段治疗脑出血。在目前的临床实践中,积极针对原发损伤的治疗(早期清除血肿和防止血肿扩大)并不能改善脑出血的预后。越来越多的研究都证实了,炎症反应在血脑屏障破坏、脑水肿、氧化应激等继发性损伤中都发挥了关键作用。使用芬戈莫德抑制淋巴细胞向中枢神经系统浸润可以改善脑出血所致的继发炎症损伤。CD4~+CD25~+调节性T细胞具有免疫调节功能,在自身免疫耐受和免疫抑制方面发挥着重要作用。在狼疮性肾炎、强直性脊柱炎、类风湿关节炎等自身免疫性炎症中,增加Treg细胞,可以延缓病情进展,改善预后。在缺血性脑卒中,敲除Tregs加重脑组织损伤,而过继转输Tregs可以减轻损伤。在出血性卒中,外周Tregs数量减少,过继转输Tregs可以减轻脑出血继发性炎症损伤。虽然过继转输Tregs可以减轻中枢神经系统炎症,但是具体机制尚不清楚。既往研究表明,Tregs可以减少中枢神经系统中炎症因子浸润、减轻血脑屏障破坏、分泌抗炎因子、调节抗原递呈、调节炎症细胞激活。这些作用主要通过两条途径,一是由其表面分子如LAG-3或CTLA-4等作用于炎症细胞,通过细胞与细胞间的直接作用调节炎症细胞的功能,二是分泌抗炎细胞因子如IL-10、TGF-β通过各个信号通路的信号转导调节炎症细胞功能发挥免疫抑制作用。小胶质细胞作为脑组织固有细胞,是最早与脑血肿成分起反应的炎症细胞参与了脑出血的病理生理过程,正是由于小胶质的激活,分泌大量的趋化因子,炎症因子、蛋白酶以及其它细胞毒性产物,介导了炎症级联反应。然而有意思的是,激活的小胶质细胞具有两面性,根据不同的作用和表面标志物分为M1型(经典激活)和M2型(替代激活)。M1型能分泌大量促炎细胞因子如IL-6、TNF-α,介导炎症级联反应,加重炎症损伤。M2型则分泌具有保护性作用的抗炎细胞因子如IL-10、TGF-β限制炎症的程度,并通过增强的吞噬功能清除坏死组织促进组织修复。Treg细胞可以通过分泌IL-10发挥免疫抑制作用.最近的研究提示,在脑出血中Treg细胞可以通过IL-10/GSK3β/PTEN信号通路诱导小胶质细胞M2型极化28,32。NOX2缺陷小鼠可以通过IL-10/STAT3诱导小胶质细胞M2型极化减轻TBI小鼠脑组织炎症损伤。STAT3是抗炎细胞因子IL-10信号通路的下游信号分子,因此我们推测在脑出血中Tregs也能通过分泌IL-10激活STAT3诱导M2型极化减轻脑出血所致炎症损伤。本研究将采用过继性转输Treg细胞的方法探讨Treg细胞在脑出血中的作用并试图阐述其具体机制。本课题主要分为以下三个部分进行研究。第一部分Tregs减轻脑出血所致炎症损伤目的:探讨Treg细胞在脑出血的神经保护作用方法:小鼠随机分为脑出血组(ICH)、假手术组(Sham),脑出血组将20ul未抗凝自体血注入小鼠右侧基底节,假手术组注入等量生理盐水。分别随机将脑出血组和假手术组分为Tregs治疗组(术后24h)和对照组(等量生理盐水)。术后采用Clark评分法评估小鼠术后1天,4天,7天的神经功能缺损评分。在脑出血96小时处死部分小鼠,用干湿重法称量脑组织含水量,Clark评分法评估小鼠神经功能缺损评分,MRI、组织切片评估血肿量变化以及Image-Pro Plus计算血肿量。ELISA检测血肿周围组织炎症细胞因子。结果:与假手术组相比,脑出血组术后神经功能明显缺损。与对照组相比,Tregs能明显减少神经功能缺损评分,ICH后脑组织的含水量减少,能明显减少ICH的血肿量。结论:Tregs治疗减轻了小鼠脑组织的炎症损伤。第二部分Tregs诱导小胶质细胞/巨噬细胞M2型极化目的:探讨Tregs减轻脑组织炎症损伤的具体机制。方法:1.小鼠随机分为脑出血组(ICH)、假手术组(Sham),脑出血组将20ul未抗凝自体血注入小鼠右侧基底节,假手术组注入等量生理盐水。分别随机将脑出血组分为Tregs治疗组(术后24h)和对照组(等量生理盐水)。在脑出血96小时处死部分小鼠,组织免疫荧光双染血肿周围组织M1型标志物CD16/32和M2型标志物CD206,ELISA检测血肿周围组织M1型相关标记物(IL-6、TNF-α)、PCR检测血肿周围组织M1型相关mRNA(CCL3、i NOS)、ELISA检测血肿周围组织M2型相关标记物(IL-10、TGF-β)、PCR检测血肿周围组织M2型相关mRNA(Arg1、Ym1)。2.BV2细胞置于Transwell六孔板下室,经LPS/IL-4刺激后按照CD4+CD25+T细胞免疫磁珠分选试剂盒说明书操作步骤分选Tregs,将Tregs细胞置于上室与下室的BV2细胞共培养72h。共培养72h后ELISA检测M1型相关细胞因子(IL-6、TNF-α)、PCR检测M1型相关mRNA(CCL3、i NOS)、ELISA检测M2型相关细胞因子(IL-10、TGF-β)、PCR检测M2型相关mRNA(Arg1、Ym1)结果:动物实验中,我们使用CD16/32作为M1型小胶质/巨噬细胞的标志物,CD206作为M2型的标志物,做了血肿周围脑组织的免疫荧光染色,与对照组相比,过继性转输Tregs后血肿周围脑组织中CD206表达升高,CD16/32表达降低。同时,Tregs治疗组IL-10、TGF-β的量明显增加而IL-6、TNF-α的量减少。此外,PCR结果显示,Tregs治疗组M2型小胶质细胞标志物Arg 1、Ym 1的表达增加,M1型标志物CCL3、i NOS的表达减少。在细胞实验中,M1型相关细胞因子IL-6、TNF-α以及相关mRNA CCL3、i NOS表达明显减少,同时M2型相关细胞因子IL-10、TGF-β以及相关mRNAArg 1、Ym 1表达明显增多。结论:Tregs可以诱导小胶质/巨噬细胞向M2型极化。第三部分Tregs通过IL-10/STAT3信号通路调节小胶质细胞极化目的:探究Tregs诱导小胶质细胞M2型极化的信号转导机制。方法:BV2细胞置于Transwell六孔板下室,按分组情况加入IL-10抗体(10μg/ml)中和IL-10,经LPS/IL-4刺激后按照CD4+CD25+T细胞免疫磁珠分选试剂盒说明书操作步骤分选Tregs,将Tregs细胞置于上室与下室的BV2细胞共培养72h。Western blot检测t-STAT3、p-STAT3和TGF-β,PCR检测mRNA(Arg1、Ym1)。结果:LPS/IL-4刺激BV2组和LPS/IL-4预刺激BV2后Tregs共培养组p-STAT3表达均增加,且Tregs治疗组增加量明显高于对照组,用IL-10抗体中和IL-10后,STAT3磷酸化水平明显降低。同时,LPS/IL-4刺激BV2组和LPS/IL-4预刺激BV2后Tregs共培养组M2型相关mRNAArg 1、Ym 1和相关蛋白TGF-β表达均增加,且Tregs共培养组增加量明显高于BV2组,用IL-10抗体中和IL-10后,Tregs的效应被逆转。结论:Tregs能通过IL-10/STAT3信号通路诱导小胶质细胞M2型极化