研究背景宫颈癌在全球女性恶性肿瘤中发病率及致死率均高居第四位,严重威胁女性身心健康,仅在中国,每年约有98,900例宫颈癌新发病例,约占全球新发病例的20%,每年约有30,500例患者因宫颈癌而死亡。既往众多学者在探索宫颈癌的发病机制方面做了大量的研究,针对宫颈癌的临床治疗在手术和放疗基础上探索了如免疫治疗、化疗及靶向治疗等,但是宫颈癌仍是一个全球性的健康难题。已经明确高危型人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）持续感染是宫颈癌的主要病因,HPV疫苗接种和早期筛查对降低宫颈癌的发病率有一定效果,但是高危型HPV感染后仅有小部分患者最终发展为宫颈癌,另外还有宫颈癌患者并不伴有HPV感染。所以除高危型HPV持续感染之外,另有其他的因素参与宫颈癌的发生发展,但目前仍有待明确,临床上也缺乏更有针对性、更有效的治疗方法,因此需要更全面深入地探究宫颈癌的发病机制,为研发更精准的治疗方法提供思路。环状RNA（circular RNA,circRNA）是非编码RNA家族中的一员,因具有独特的共价闭合环状结构而得名。环状RNA具有稳定性好、表达丰度高、物种保守性高的特点,并且显示出细胞和组织特异性。环状RNA在人体中广泛存在且在机体生理及病理过程中发挥重要的作用。环状RNA能通过多种途径发挥调节作用。首先,环状RNA可以海绵样吸附与其miRNA结合位点相结合的微小RNA（microRNA,miRNA）,后者可以通过调节靶蛋白的表达和活性影响细胞的代谢过程。其次,环状RNA可调节RNA选择性剪接或转录,包括在前体mRNA剪接的环节与线性RNA竞争和通过与RNA聚合酶Ⅱ复合体相互作用促进环状RNA亲本基因的转录。再者,环状RNA可与RNA结合蛋白相互作用调节蛋白翻译效率。另外,少数环状RNA具有翻译功能,能编码具有生物活性的短肽。近年来随着RNA测序、RNA芯片和生物信息学工具的广泛应用,环状RNA在越来越多疾病中的作用及机制被逐渐阐明,其在恶性肿瘤中的作用也倍受关注。目前已发现环状RNA在多种癌症中差异表达,可用于肿瘤诊断,且与患者预后生存有关,有望成为新的肿瘤标记物或预后评估指标。环状RNA通过多种途径调节基因的转录和翻译,促进或抑制癌细胞增殖、凋亡、浸润和转移等,从而调节肿瘤进展。已有报道宫颈癌中也存在环状RNA的异常表达,其与HPV感染、癌变发生发展及放疗敏感性等有关。现有研究发现的环状RNA在宫颈癌中的作用机制主要为通过吸附miRNA降低后者对下游作用靶点的抑制作用,最终促进或抑制癌细胞的增殖、凋亡、迁移与侵袭等。环状RNA在宫颈癌中的研究现在尚处于初级阶段,其作用及机制仍未完全明确,对宫颈癌中非编码RNA调控体系的探索,将有助于更全面地了解宫颈癌的发病机制、探寻新的治疗切入点。本研究旨在利用环状RNA芯片对宫颈癌组织中环状RNA表达情况进行检测,初步阐明宫颈癌组织环状RNA表达谱,为后续研究提供基础。通过验证及初步分析,从差异表达的环状RNA中挑选了 hsa_circ₀000745作为深入研究对象。已有研究发现hsa_circ₀000745在胃癌患者外周血及癌组织中表达均显著下调,且其表达水平与部分临床病理因素有关,hsa_circ₀000745的表达水平在胃癌筛查及诊断上显示出较高的敏感性和特异性,但其在胃癌中的具体作用及机制不明确。hsa_circ₀000745在宫颈癌中的作用尚未见报道。本研究对hsa_circ₀000745在宫颈癌中的表达进行分析,并探讨其对宫颈癌进展的影响及作用机制,为探索宫颈癌发病机制及临床治疗新方法提供新的思路和方向。第一部分宫颈癌组织中差异表达环状RNA的筛选及鉴定研究目的:检测宫颈癌组织中环状RNA的表达情况,分析其中差异表达的环状RNA并进行验证。研究方法:利用环状RNA芯片对5组宫颈癌及配对癌旁组织中的环状RNA表达情况进行检测,并通过对比分析阐明宫颈癌组织中差异表达的环状RNA,并对其中10个差异表达的环状RNA利用qRT-PCR进行验证。研究结果:1.利用环状RNA芯片在宫颈癌及癌旁组织中共检测到3008种环状RNA的表达。通过对比分析,发现相对于癌旁组织,宫颈癌组织中有178种环状RNA表达异常,包括77个表达上调的环状RNA及101个下调的环状RNA,其中以外显子来源的环状RNA为主（149/178）。环状RNA芯片检测报告已上传至Gene Expression Omnibus（GEO）网站（编号:GSE102686）。2.从差异表达的环状RNA中挑选10个进行验证分析,包括hsa_circ₀000745,hsa_circ₀000520,hsa_circ₀000515,hsa_circ₀084940,hsa_circ₀006174,hsa_circ₀064735,hsa_circ₀043280,hsa_circ₀062432,hsa_circ₀065898 以及hsa_circ₀031027。利用qRT-PCR对它们在宫颈癌中的表达水平进行检测,结果显示,与癌旁组织相比,宫颈癌组织中hsa_circ₀000745,hsa_circ₀000520,hsa_circ₀000515,hsa_circ₀084940 和 hsa_circ₀006174 表达上调（P<0.05）,与芯片结果一致;hsa_circ₀064735,hsa_circ₀043280,hsa_circ₀062432 以及hsa_circ₀031027 表达下调（P<0.01）,也与芯片结果一致;但 hsa_circ₀065898的表达差异无统计学意义（P>0.05）,与芯片结果不一致。qRT-PCR的检测结果显示芯片结果基本可靠。3.对上述9个差异表达环状RNA的表达水平与宫颈癌患者临床病理因素之间的关系进行分析,主要包括患者的临床分期、肿瘤分化程度、肿瘤直径、宫颈间质浸润深度、是否伴有淋巴结转移、是否伴有脉管间隙浸润等因素。结果显示,hsa_circ₀000745在低分化肿瘤患者中的表达水平显著高于高分化和中分化的患者（P=0.019）;在脉管间隙浸润阳性的患者中较无脉管间隙浸润的患者表达明显升高（P=0.028）。hsa_circ₀031027在肿瘤深间质浸润的患者中较浅间质浸润的患者表达水平显著降低（P<0.001）。未发现其他7个环状RNA的表达水平与宫颈癌患者的临床病理因素有关（P>0.05）。研究结论:1.与癌旁组织相比,宫颈癌组织中178种环状RNA表达水平发生改变,提示环状RNA差异表达与宫颈癌相关。2.hsa_circ₀000745和hsa_circ₀031027在宫颈癌中的差异表达与患者的部分临床病理因素相关,提示二者可能与宫颈癌的进展相关。第二部分 hsa_circ₀000745对宫颈癌细胞生物学行为的影响研究目的:检测hsa_circ₀000745及SPECC1 mRNA在宫颈癌中的表达情况,分析其与患者临床病理因素之间的关系,探讨hsa_circ₀000745在宫颈癌中的功能。研究方法:扩大实验样本例数,利用qRT-PCR检测59对宫颈癌组织及配对癌旁组织中hsa_circ₀000745及其同基因来源的mRNA（SPECC1 mRNA）的表达水平,并分析hsa_circ₀000745与患者临床病理因素之间的关系。利用细胞转染、细胞凋亡及增殖检测、Transwell及动物实验等探讨hsa_circ₀000745对宫颈癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。研究结果:1.与癌旁组织（1.025±0.059）相比,hsa_circ₀000745在宫颈癌组织中表达水平显著上调（3.421±2.307,P<0.001）;与癌旁组织（1.012±0.018）相比,SPECC1 mRNA在宫颈癌中表达也显著上调（2.320±1.661,P<0.001）。进一步分析发现hsa_circ₀000745及SPECC1 mRNA 的表达呈正相关（r=0.449,P<0.001）。2.与肿瘤高分化和中分化组的患者（2.381±1.588）相比,肿瘤低分化组的患者中hsa_circ₀000745表达水平显著升高（3.960±2.313,P=0.005）。与无脉管间隙浸润组（2.673±1.482）相比,脉管间隙浸润组中hsa_circ₀000745表达水平更高（3.900±2.543,P=0.026）。3.CCK-8实验结果发现,抑制hsa_circ₀000745表达后CaSki、SiHa和HeLa细胞的增殖能力明显降低（P<0.05）;hsa_circ₀000745下调的CaSki细胞在裸鼠皮下接种形成的移植瘤体积明显小于对照组（P=0.023）。4.Transwell 实验发现,抑制 hsa_circ₀000745 表达后 CaSki、SiHa 和 HeLa 细胞的迁移及侵袭能力均明显降低（P<0.01）。抑制hsa_circ₀000745表达对细胞凋亡能力无影响（P>0.05）。研究结论:1.hsa_circ₀000745在宫颈癌组织中表达升高,且与患者肿瘤分化程度及脉管间隙浸润情况相关,提示其参与宫颈癌的发展。2.抑制hsa_circ₀000745表达后宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力均明显降低,裸鼠成瘤能力下降,提示hsa_circ₀000745在宫颈癌发展进程中发挥促癌因子的作用。第三部分hsa_circ₀000745在宫颈癌中的作用机制研究研究目的:探究hsa_circ₀000745在宫颈癌中的作用靶点和作用机制。研究方法:利用TargetScan和miRanda数据库对可能与hsa_circ₀000745结合的miRNA进行预测,通过 Gene Ontology（GO）和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway分析,结合第二部分中hsa_circ₀000745对宫颈癌细胞生物学功能的影响,筛选可能与hsa_circ₀000745相关的靶基因及蛋白。通过qRT-PCR、Western blot、小干扰RNA转染及Transwell实验对预测的miRNA及靶蛋白进行验证,并针对有影响的靶蛋白进行反向验证试验。研究结果:1.联合TargetScan和miRanda计算出与hsa_circ₀000745存在结合潜力的、排名前 5 位的 miRNA,分别为 hsa-miR-9-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-526b-5p、hsa-miR-578 及 hsa-miR-29a-5p。GO 和 Pathway 分析结合 hsa_circ₀000745 对宫颈癌细胞生物学行为的影响,预测E-cadherin、β-catenin、Vimentin、p-RAS、p38 MAPK可能为hsa_circ₀000745的作用靶蛋白。2.qRT-PCR检测结果显示,抑制hsa_circ₀000745的表达水平对CaSki、SiHa及 HeLa 细胞中 hsa-miR-9-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-526b-5p、hsa-miR-578及hsa-miR-29a-5p的表达没有显著影响（P>0.05）。3.Western blot检测结果显示hsa_circ₀000745表达下调后,宫颈癌细胞CaSki、SiHa及HeLa中E-cadherin的表达水平均显著升高（P<0.01）,而β-catenin、Vimentin、p-RAS、p3 8 MAPK 表达无明显变化。4.在 hsa_circ₀000745 表达下调后的 CaSki、SiHa 及 HeLa 细胞中,干扰 E-cadherin的表达可逆转下调hsa_circ₀000745对癌细胞迁移和侵袭的抑制作用（P<0.01）。研究结论:hsa_circ₀000745通过抑制E-cadherin的表达促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭,从而促进肿瘤进展。