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背景:原发性肝癌是上皮来源的比较恶性的肿瘤,也是我们国家最常见的肿瘤,其治疗及预后恢复仍是科学研究的一大难题。淋巴道转移作为其早期转移方式,是影响肝癌预后的一个重要因素。因此,研究肝癌的淋巴道转移的相关联分子机制是探寻淋巴道转移相关蛋白的重要一步。苹果酸脱氢酶2是一种柠檬酸循环酶,它促进苹果酸盐双向转化为草酰乙酸酯,虽然不是三羧酸循环的关键酶,但也在其中起着不可替代的作用。苹果酸脱氢酶2也通过线粒体内膜穿过苹果酸而涉及到糖异生活动。除此之外,细胞氧化所需要的能量通过苹果酸和天冬氨酸梭菌的作用将NADH从胞质氧化磷酸化转移电子以产生线粒体NADH。苹果酸脱氢酶2的表达水平降低还导致DNA合成效率显着降低。本课题组前期建立了来源于同一亲本,同一遗传背景的两株相似细胞株Hca-F细胞和Hca-P细胞,不同的是,我们发现Hca-F细胞的淋巴转移率>70%,而Hca-P细胞的淋巴转移率<30%,其中的苹果酸脱氢酶2在基因和蛋白水平存在显著差异,在蛋白水平上Hca-P细胞是Hca-F细胞的2.73倍。应用免疫蛋白印迹、Transwell小室、流式细胞仪等技术验证肿瘤细胞的生物学特征和功能。研究苹果酸脱氢酶2与小鼠腹水型肝癌的相互关系,有利于进一步讨论它在肿瘤增殖转移等方面的作用机制,为肝癌的靶向干预治疗提供新的平台。目的:本研究以Hca-P细胞为研究对象,探讨下调苹果酸脱氢酶2基因表达水平对细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。方法:复苏本组先前建立、液氮保存的Hca-P和Hca-F细胞,利用qRT-PCR和Western Blot技术检测MDH2在mRNA和蛋白水平的表达。构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-MDH2质粒表达载体和其阴性对照pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA,将Hca-P细胞分为空白对照组（P组）,稳定转染pGPU6/GFP/Neo-MDH2-shRNA的MDH2-shRNA转染组（Pmd组）和稳定转染pGPU6/GFP/Neo-NC的阴性对照组（Pmn组）三组细胞,转染约48h后荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白的表达量,筛选稳定转染细胞,qRT-PCR和Western Blot技术检测以上各组细胞中MDH2在mRNA和蛋白水平的表达,应用Transwell小室实验、CCK-8法和流式细胞仪分别检测MDH2低表达对Hca-P细胞迁移、侵袭及细胞增殖和凋亡的影响。结果:1、MDH2在基因水平上的表达Hca-P细胞是Hca-F细胞2.574倍,在蛋白水平上Hca-P细胞是Hca-F细胞的2.248倍。2、绿色荧光检测MDH2靶向shRNA成功下调小鼠肝癌Hca-P细胞中MDH2基因的表达。qRT-PCR和Western Blot检测显示,Pmd转染组MDH2在mRNA和蛋白水平的表达量均较P组和Pmn组显著下降（P<0.05）,而P组和Pmn组之间表达量并未见有明显差异（P>0.05）。3、Transwell实验显示,P组、Pmd组、Pmn组迁移细胞数目为208.5±13.44,860.5±53.03,278±2.83,其差异有统计学意义（P<0.05）。Transwell基质胶实验,P组、Pmd组、Pmn组侵袭细胞数目为168±12.34,460±37.2,149.5±17.9,其差异有统计学意义（P<0.05）。4、Cell counting kit8增殖实验分别检测P细胞组、Pmd组细胞与Pmn组细胞在0小时、24小时、48小时、72小时、96小时等时间的吸光值,增殖试剂反应时间为1小时,结果显示为P组细胞在5个不同的时间段里吸光值均数±标准差的值分别为0.186±0.011、0.341±0.016、0.609±0.009、0.639±0.013、0.814±0.029;Pmd细胞组5个时间段吸光值分别为0.121±0.002、0.363±0.024、1.002±0.089、1.706±0.012、1.832±0.042;Pmn组细胞5个时间段吸光值分别为0.129±0.034、0.349±0.026、0.648±0.038、0.736±0.086、0.893±0.034,结果提示P、Pmd、Pmn这三种不同组细胞在培养24小时之前,增殖速率相近,细胞增长数量相近,总细胞数无显著的差异（P>0.05）,从细胞培养近48小时开始各组细胞的总数量开始有所差别,48小时、72小时、96小时的时间点比较均具有统计学意义（P<0.05）,且Pmd细胞增殖能力自始至终都高于Pmn细胞组及P细胞组,Pmn组与P组在5个时间段的增殖能力无显著差异,不具统计学意义（P>0.05）。5、流式细胞仪检测显示,P组、Pmd组、Pmn组细胞凋亡率分别为5.98%±0.11%,3.07%±0.3%,6.03%±0.27%,Pmd组的细胞早期凋亡较P组和Pmn组明显减少（P<0.05）。结论:MDH2蛋白对小鼠肝癌细胞增殖、侵袭和迁移可能起着重要的抑制作用、对早期凋亡能力具有促进作用。MDH2可能作为肝癌淋巴道转移相关机制的一个环节,为研究靶向分子药物治疗等提供新思路。