背景和目的：自从十九世纪末肾素发现以来,基础医学对肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system, RAS)的认识和研究已经经历了一个多世纪。RAS作为心血管系统的重要调节因素,对动脉粥样硬化(atherosclerosis disease, AS)疾病的发生和发展发挥了关键的作用。众所周知,AS疾病的主要危险因素有高血压、糖尿病、以胰岛素抵抗为特征的代谢综合征等,而RAS系统的激活在上述危险因素的发生、发展中扮演着重要的作用。在上述疾病中由血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖与凋亡参与的血管重构促进了病程的进展。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是RAS系统的一个主要活性成分,AngⅡ通过其1型(angiotensin 1, AT1)受体发挥其对心血管系统的作用。局部血管的RAS能直接影响血管的功能状态以及内皮细胞功能,造成VSMC的增殖和肥大,从而导致了高血压、AS疾病的血管重构。AngⅡ能促进原癌基因和多种生长因子和其它激素如内皮素(endothelin, ET)的mRNA表达,使VSMC增殖、肥大及细胞间基质增加。反过来,AngⅡ也可以通过上调一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的nRNA表达,一氧化氮能使血管平滑肌细胞中Bcl-2表达降低,而使Bax、P53和Fas表达升高,这些结果进一步证明了AngⅡ能介导VSMC的凋亡,抑制VSMC生长。但在高血压、糖尿病及代谢综合征患者体内,促生长因子和生长抑制因子两者间的平衡关系被打破,此时VSMC表现为肥大和增殖,并且对体内的血管活性物质的反应性升高,导致血管壁增厚。细胞凋亡过程是多种调节基因参加的复杂的分子水平调节机制,目前为止研究较多的和平滑肌细胞凋亡相关的基因有Bcl-2、p53、c-myc、fas等,上述基因各自通过不同的信号传导通路影响细胞的凋亡过程。本实验拟研究这两种RAS阻滞剂在拮抗AngⅡ诱导的Wista大鼠VSMC凋亡相关基因Bcl-2及Fas表达方面的作用,从而探讨这两种药物对AngⅡ诱导的VSMC平滑肌细胞增殖的作用。RAS在AS相关疾病患者中均有不同程度的激活,该系统的阻断剂是目前AS相关疾病临床治疗的基础药物,RAS的阻滞剂肾素血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensinconverting enzyme inhibitor, ACEI)及AT1受体拮抗剂主要是以拮抗AngⅡ的生理作用而发挥其治疗作用的。目前RAS系统阻断剂药物的临床研究主要局限于其对血压的控制和对心脏重构的影响方面,而关于RAS系统与血管平滑肌细胞增生肥大导致的血管重构及其干预因的研究尚且不多,本课题研究了AngⅡ对Wista大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)凋亡相关基因Bcl-2和Fas表达的影响以及肾素血管紧张素转化酶抑制剂开博通和血管紧张素受体1拮抗剂氯沙坦对AngⅡ这一作用的干预作用,以期探索RAS阻滞剂对AS相关疾病的临床防治中更多的理论依据。方法：1.培养Wista大鼠胸主动脉VSMC。1)选用雄性Wistar大鼠,断颈处死,取其胸主动脉原代培养；VSMC传代培养采用常规贴壁细胞培养方法进行。传代至5-10代,用于实验分组。2)取培养的VSMC制作半薄及超薄切片,采用免疫细胞化学染色后,置于光学显微镜及电子显微镜下观察,并鉴定是否为目的细胞。2.将培养的VSMC随机进入如下分组1)对照组VSMC用含0.5%FCS的培养液培养,不加特殊试剂干预。2)按照不同AngⅡ浓度(10-8、10-7、10-6、10-5和10-4 mol/L)对VSMC的影响及开博通(10-5 mol/L)、氯沙坦(10-5 mol/L)和上述两药合用(5×10-6 mol/L)的干预作用分组。3)按照不同AngⅡ作用时间(12、24、48和72小时)对VSMC的影响及开博通(10-5 mol/L)、氯沙坦(10-5 mol/L)和上述两药合用(5×10-6 mol/L)的干预作用分组。4)应用流式细胞仪对上述各组VSMC凋亡相关基因Bcl-2及Fas的表达阳性率进行检测。结果：1.AngⅡ、开博通和氯沙坦对Bcl-2表达的影响1)给予VSMC以不同剂量AngⅡ作用后,细胞内Bcl-2表达呈逐渐升高趋势,表现出在一定范围内的剂量依赖性；除10-8 mol/L组外,AngⅡ其余各浓度组Bcl-2表达量较对照组显著增加(P<0.01)；但10-4 mol/L时,Bcl-2表达量较10-5mol/L时有所下降；加入开博通、氯沙坦和开博通+氯沙坦干预后,Bcl-2表达量均明显下降；与AngⅡ组比较,当AngⅡ分别为10-7、10-6、10-5和10-4 mol/L时,开博通组Bcl-2表达量分别下降65.63%、54.3%、52.67%和65.01%(P<0.05或P<0.01)；氯沙坦组Bcl-2表达量分别下降41.88%、32.32%、39.62%和48.25%(P<0.05或P<0.01)；开博通+氯沙坦组Bcl-2表达量分别下降54.08%、80.18%、75.33%和80.72%(均P<0.01)。其中以开博通+氯沙坦组Bcl-2表达量下降最显著。2)AngⅡ刺激下Bcl-2的表达量亦与作用时间相关,呈现时间依赖性,随作用时间延长,表达量增加。作用12、24、48和72小时时,Bcl-2表达量分别为6.35±1.22、35.58±5.06、38.32±5.15和40.47±5.25。与对照组比较,除12小时外,均有显著性统计学差异(均P<0.01)。加入开博通、氯沙坦后,Bcl-2表达量较AngⅡ组有明显下降,其下降幅度亦具有时间依赖趋势,其中开博通组于作用24、48和72小时分别下降54.30%、67.74%(均P<0.05)和71.6%(P<0.01)；氯沙坦组于上述三个时间分别下降32.32%、55.24%和60.31%(均P<0.05)；开博通+氯沙坦组于上述三个时间分别下降80.18%、80.19%和81.76%(均P<0.01)。但开博通、氯沙坦组有随作用时间延长,有下降幅度增大的趋势,而开博通+氯沙坦组则无这种现象。2、AngⅡ、开博通和氯沙坦对Fas表达的影响1)予以不同浓度的AngⅡ(10-7、10-6、10-5和10-4 mol/L)刺激VSMC 24小时,Fas表达量分别为4.27±0.64、3.55±0.08、5.56±0.44和6.02±0.35,与对照组比较,均显著降低(P<0.05),但10-7 mol/L以上无明显剂量依赖性。经开博通、氯沙坦预处理后,除Angll 10-7 mol/L组外,余组均增加Fas表达。与AngⅡ组比较,当AngⅡ为10-7、10-6、10-5和10-4 Mol/L时,Fas表达量于开博通组分别增加了58.66%、66.66%、54.45%和60.16%(均P<0.05)；于氯沙坦组分别增加了53.36%、59.41%、44.46%和52.71(均P<0.05)；开博通+氯沙坦组分别增加了74.76%、75.95%、65.99%和70.14%(均P<0.01)。其中以开博通+氯沙坦组增加尤为显著。2)AngⅡ刺激VSMC不同时间,除12小时组外,其余各时间组Fas表达均较对照组显著降低(P<0.05),于作用24、48和72小时时分别为4.55±0.08、4.92±0.15和4.76±0.12,无明显时间依赖性；分别以开博通、氯沙坦及开博通+氯沙坦预处理VSMC后,除12小时外,Fas表达量于24、48和72小时均较AngⅡ组显著增加,虽有随作用时间延长而Fas表达量增加的趋势,但各时间组间比较无显著性差异；其中开博通组于上述三个时间分别增加了66.66%、70.25%和73.68%(均P<0.01)；氯沙坦组分别增加了59.41%、62.86%和68.62%(均p<0.01)；开博通+氯沙坦组分别增加了73.1%、73.51%和76.46%(均p<0.01)；其中以开博通+CT组增加最为显著。结论：1.AngⅡ可以促进Wista大鼠VSMC Bcl-2的表达,并在一定范围内呈剂量和时间依赖性。2.AngⅡ可以抑制Wista大鼠VSMC Fas的表达,但并未发现有明显的剂量和时间依赖性。3.开博通、氯沙坦可以对抗AngⅡ介导的Wista大鼠VSMC Bcl-2表达升高,这种对抗作用在开博通+氯沙坦组更为显著。4.开博通、氯沙坦可以对抗AngⅡ介导的Wista大鼠VSMC Fas表达减低,这种对抗作用在开博通+氯沙坦组更为显著。创新点：1.本研究发现AngⅡ可以增加Wista大鼠血管平滑肌细胞Bcl-2的表达,且存在剂量和时间依赖性,血管紧张素转化酶抑制剂开博通及血管紧张素1受体拮抗剂氯沙坦可拮抗AngⅡ这一作用,该结论在国内尚未见报道。2.本研究结果显示AngⅡ可以降低Wista大鼠血管平滑肌细胞Fas的表达,且没有明显的剂量和时间依赖性,血管紧张素转化酶抑制剂开博通及血管紧张素1受体拮抗剂氯沙坦可拮抗AngⅡ这一作用,该结论在国内尚未见报道。