宫颈癌是常见的女性肿瘤,宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia, CIN)是一组与宫颈浸润癌密切相关的癌前期病变,反映了宫颈癌发生中连续发展的过程,即由CIN1→CIN2→CIN3→浸润癌的一系列病理变化。高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染被认为是宫颈癌发病的重要因素。一般从HPV最初感染到癌前病变,最终演变为宫颈浸润癌至少需要10-15年。这些提示HPV感染只是一个始动因素。肿瘤生长不仅取决于恶性肿瘤细胞的遗传改变,也取决于基质、血管、浸润炎症细胞等肿瘤微环境(tumor microenvironment)的改变。肿瘤微环境中大量炎症细胞浸润所致肿瘤相关性炎症已经成为癌症的第七大标志,肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAM)与癌症发生、进展和预后不良有关。本实验以巨噬细胞对宫颈癌细胞生物学行为的影响为主线,探讨研究巨噬细胞在宫颈内皮瘤变进程和宫颈癌发生和发展中的作用。肿瘤相关巨噬细胞的重要作用不仅表现在其数量的多少,更重要在于其不同的功能,即不同亚型表现不同的功能。为了评估巨噬细胞的数量和亚型,本实验以代表癌症进展各期的临床组织样本即低度鳞状上皮内瘤变(low grade squamous intraepithelial lesions, LSIL,即CIN1),高度鳞状上皮内瘤变(high-grade squamous intraepithelial lesions, HSIL,即CIN2、3)和浸润癌为对象,用两种巨噬细胞标志物CD68和CD163做免疫组化检测,结果显示CD68和CD163的表达都随着宫颈病变的进展而增高,并且随着病程进展,迁移到上皮组织的巨噬细胞增多,其结果有统计学意义；由此推测,肿瘤微环境中的肿瘤细胞分泌各种细胞因子,吸引单核细胞迁移到肿瘤组织中；同时微环境中的TAMs可表达一系列细胞因子,刺激肿瘤细胞增殖和存活。表明TAMs在宫颈癌形成中起重要作用；CD163的表达及巨噬细胞数量是CIN进展的重要因素,有可能作为CIN进展与宫颈癌的预测重要指标。为了探讨TAM对宫颈癌细胞生物学行为的影响,TAM是否在宫颈癌的发展(进展)也同样起重要作用,在体外进行了巨噬细胞对三种宫颈癌细胞生物学功能的影响研究。首先通过体外诱导培养的人THP-1单核细胞系,使其成为分化良好的巨噬细胞：观察诱导分化的巨噬细胞对三种宫颈癌细胞(HeLa、SiHa和C33A)增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移力的影响：基质金属蛋白酶MMP-9活性检测、以及巨噬细胞对各种炎症细胞因子分泌的影响。间质的巨噬细胞主要通过分泌细胞因子在肿瘤微环境中起作用,而浸润到癌巢的巨噬细胞可以与肿瘤细胞直接接触。因此本实验在对宫颈癌细胞和巨噬细胞的共培养设计上,分为接触共培养和非接触共培养。通过CFSE染色计算分裂指数,发现与巨噬细胞共培养能增强宫颈癌细胞HeLa和SiHa的增殖能力,且接触共培养比非接触共培养促增殖效果更强。细胞周期检测结果显示,与巨噬细胞共培养的肿瘤细胞G0-G1期减少,S期增加,DNA合成增加而使细胞增殖加快。说明宫颈癌细胞和巨噬细胞可溶性成分相互作用,对宫颈癌细胞的生长起到促进作用；虽然三种细胞同为宫颈癌细胞,但共培养对其生物学功能的影响不尽相同。凋亡是大多数肿瘤放化疗的切入点,肿瘤细胞抗凋亡能力的提高能帮助其逃避免疫系统及药物的攻击,促进肿瘤的发展。我们研究了共培养对宫颈癌细胞抗凋亡能力影响,通过紫外线诱导凋亡,共培养使三种细胞抗凋亡能力都提高。划痕实验和transwell迁移实验都用于检测细胞的运动能力,细胞的迁移和运动在机体免疫、损伤修复等生理过程以及炎症、癌症转移等病理过程中都起着重要作用。实验结果显示共培养后的SiHa细胞和C33A细胞的迁移能力增强,而HeLa细胞共培养前后迁移能力无变化。基质金属蛋白酶(MMPs)活性上调与肿瘤侵袭、转移有关。MMP-9是一种重要的MMPs。明胶酶谱法检测结果表明THP-1细胞能分泌大量的MMP-9;三种宫颈癌细胞分泌低水平的MMP-9;而共培养条件下不能使THP-1细胞或宫颈癌细胞分泌更多的MMP多,该结果表明,MMP-9主要由THP-1细胞分泌,MMP-9分泌表达有利于肿瘤的侵袭和转移。细胞因子复杂的网络在肿瘤微环境中起重要作用,各种细胞因子的表达水平能反映肿瘤微环境中的免疫状态。为了解巨噬细胞和宫颈癌细胞相互作用后细胞因子的变化,采用BCA法检测了几种重要的炎症因子的分泌。结果显示：共培养能诱导大量IL-6的分泌,且接触共培养诱导产生IL-6比非接触共培养更多,推测可能是膜表面受体也参与IL-6的诱导。无论是接触共培养还是非接触共培养的细胞上清IL-8和IL-1β分泌均增加,两种共培养方式之间并无显著性差异,说明IL-8和IL-1β的诱导是靠细胞分泌的可溶性成分来达到。三种宫颈癌细胞上清均未检测到TNF,在共培养过程中,观察到THP-1产生的TNF-a一直处于低水平,共培养也未能诱导THP-1产生更多TNF-α。在共培养上清中未检测出高水平IL-10,低水平IL-12这样典型的M2特性,推测诱导后的THP-1表现为介于M1M2之间的表型,更接近M2。虽然未诱导成典型的M2表型,但说明不完全的M2巨噬细胞就能促进宫颈癌的增殖和迁移,提高抗凋亡的能力。肿瘤细胞在体外的生长环境与体内具有一定的差异,因此,在体外实验的基础上进行了裸鼠成瘤实验。混合接种组(诱导后THP-1细胞和SiHa细胞)肿瘤生长速度快,体积明显大于单纯接种组(SiHa细胞),且平均瘤重约为单纯培养组的2倍；免疫组化结果显示肿瘤有大量巨噬细胞浸润,且肿瘤细胞高表达Ki-67,提示巨噬细胞的浸润使其恶性程度增强。综上所述,通过体内体外实验及组织标本检测,较为系统地对巨噬细胞在宫颈癌发生和发展中的作用做了初步探讨；在巨噬细胞和宫颈癌细胞相互作用中,除了分泌可溶性成分,细胞与细胞的物理接触也有助于促进肿瘤细胞生长。不完全M2表型的巨噬细胞能促进肿瘤细胞增殖,提高肿瘤细胞抗凋亡和迁移能力。有鉴于此,针对肿瘤相关巨噬细胞的靶向治疗有可能成为宫颈癌治疗的新途径。