高F值寡肽是蛋白酶作用于食物蛋白后形成的一种低分子量生理活性肽，支 链氨基酸(BCAA)即亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)含量高，而芳 香族氨基酸(AAA)即苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)含量低，两者的摩尔比称 为F值(Fischer Ratio)。它除具有营养功能且更容易被人体消化吸收以外，还有 广泛的生理调节功能，如降血压、降低胆固醇、免疫强化等特殊保健功能。利用 低值鱼制备高F值寡肽，不仅可以作为鱼蛋白精深加工的一种产物，也是生化制 药、保健食品的一个重要发展方向。 本文研究了两步酶解鲮鱼蛋白制备高F值寡肽的工艺及其过程监测。提出两 步酶解鲮鱼蛋白、凝胶过滤分离制取高F值寡肽的技术路线，通过过程监测对酶 解和产物分离工艺条件进了优化研究，揭示了酶解及产物生成的机制。主要内容 如下： 一、胃蛋白酶酶解鲮鱼蛋白的研究。 1、研究了酶解过程中酶/底物比、酶解时间、底物浓度以及pH值等因素对鲮 鱼蛋白水解程度的影响。结果表明：随着酶/底物比的升高，或酶解时间的延长，水解度、可溶性肽生成率和氮利用率均呈上升趋势；随着蛋白质浓度的增大，水 解度、可溶性肽生成率和氮利用率则显示出先升高随后降低的规律，在蛋白质浓 度为1.57g/L时，这三个指标达到最大值；恒定pH值体系中的水解效果较自然pH 值体系中的好。 2、通过凝胶渗透色谱(GPC)分析不同酶/底物比和不同酶解时间所得酶解液中 蛋白质的分子量分布，确定胃蛋白酶酶解鲮鱼蛋白的优化酶解条件是：恒定 pH2.0±0.2，温度为37±0.5℃，酶用量为2.5％，水解时间2 h，底物浓度为1.57 g/L。在此条件下，蛋白水解度为15.51％，可溶性肽生成率为31.01％，氮利用率为 45.64％，分子量低于1500Da的蛋白含量为35.96％。 二、回收第一部酶解液中寡肽产物的研究。 系统对比了活性炭吸附法和凝胶层析法去除第一步酶解液中芳香族氨基酸 同时分离出分子量低于1500Da寡肽产物的效果。结果表明： 1、经粉末活性炭吸附后，滤液中蛋白混合物的F值可达到13.11，吸附后分子 量大于5000Da的蛋白组分含量从吸附前的22.61％增加到79.24％，而分子量低于 1500Da的组分含量则从31.20％减少到4.58％，因而寡肽的回收率太低，没有实际应用价值； 2、采用Sephadex G15凝胶过滤法分离第一步酶解液，得到了A、B、C、D、E、F和G7个区的分离产物，其中F区在280nm紫外检测波长下没有吸收。经氨基酸分析和GPC分子量分布测定，F区蛋白的F值达到15.42，分子量低于1500Da的蛋白组分含量占51.51％。因此，选用凝胶过滤法对第一步酶解液进行分离。经比较不同洗脱液、样品浓度、上样量以及洗脱流速等分离因素，得到去除芳香族氨基酸效果较好、分离出分子量低于1500Da的蛋白含量较高的优化条件为：第一步酶解液直接上柱，用0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)作为洗脱液，进样量为20mL，洗脱速度为2.5mL/min，在214nm监测下收集F值达到15.42的F区域洗脱液进行下一步酶解。 三、α-胰凝乳蛋白酶二次酶解及产物性质的研究。 1、上述F组分经减压浓缩后用作第二步酶解底物，α-胰凝乳蛋白酶在不同酶解时间和不同酶用量条件下进行酶解，用HPLC检测酶解液得到肽谱。结果表明第二步酶解进行0.5h后，酶解液中产生了多个在214nm和280nm下均有吸收的峰，但其中的峰8很特别，它的的全波长扫描显示峰8只在214nm下有吸收，这表明α-胰凝乳蛋白酶把某些肽段上的芳香族氨基酸酶切掉，从而出现完全不含芳香族氨基酸的寡肽(峰8)。 2、随着酶解时间的延长或酶用量的增加，肽谱图显示酶解液中各个吸收峰的峰值不断升高，但是峰的数量并没有明显的变化。确定优化的酶解条件为：酶解时间0.5h，酶用量为2％。氨基酸组成分析表明，第二步酶解液中肽的F值为19.85。