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实验目的:成牙本质细胞是抵御致龋菌感染的重要屏障,这些细胞的存活对牙髓炎的预后有重要意义。研究发现自噬在成牙本质细胞炎症损伤修复中发挥重要作用。Fox03a属于转录因子FoxO家族,可参与对自噬的转录性调节。但调控炎症所诱导的成牙本质细胞自噬的具体转录因子尚不明确。本实验利用人炎症牙髓组织和在体外经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的小鼠牙乳头细胞系(mDPC6T),探讨转录因子Fox03a通过调节自噬参与成牙本质细胞炎性损伤修复的作用机制。实验方法:临床收集人第三磨牙或正畸拔除牙,并根据牙髓状况将其分为健康组、龋病组和不可逆性牙髓炎组。分别提取牙髓组织进行免疫印迹实验;牙齿脱矿处理后进行组织切片以备用。利用免疫印迹实验检测人牙髓组织中肿瘤坏死因子TNFa,转录因子Fox03a和自噬相关指标的表达量;利用免疫组织化学实验检测Fox03a和自噬相关蛋白在成牙本质细胞中的表达部位;利用免疫荧光实验观察随炎症程度的加深,Fox03a在人牙髓组织细胞中的亚细胞定位的变化。在体外,用1μg/ml的LPS对小鼠前成牙本质细胞mDPC6T分别给予6小时、12小时、24小时处理建立成牙本质细胞炎症损伤模型。培养终止后,用免疫印迹实验检测Fox03a和自噬相关指标蛋白水平的表达,用细胞免疫双荧光实验检测FoxO3a与LC3的共定位及Fox03a的细胞核转位变化。最后,用RNA小干扰技术将Fox03a敲低,免疫印迹实验检测Fox03a减少后自噬相关蛋白量的变化。实验结果:免疫印迹和免疫组织化学实验结果显示,Fox03a和自噬相关蛋白(Beclinl、Atg5-Atg12、LC3)在成牙本质细胞层和相邻组织的表达随着炎症程度的增加而显著上升(P<0.05);组织免疫荧光实验结果显示随炎症程度的增加,Fox03a在成牙本质细胞胞质和胞核的表达量逐渐增加;在体外实验中,一定浓度范围内的LPS刺激使自噬相关蛋白(Beclinl、Atg12-Atg5、LC3)和Fox03a在炎症早期显著增加(P<0.05);LPS刺激促进Fox03a的核转位,并可观察到Fox03a与LC3在胞质中有共定位;敲低Fox03a可观察到自噬相关蛋白LC3、Beclin1、Atg12-Atg5、LAMP2表达降低,而自噬底物蛋白p62表达增加。实验结论:FoxO3a通过对自噬的调节参与成牙本质细胞的炎性损伤修复过程。