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为获得微小隐孢子虫表面粘附相关蛋白基因,从而获得疫苗的候选基因。本研究构建微小隐孢子虫核糖体展示文库,利用新生犊牛小肠上皮细胞对体外翻译蛋白质进行黏附筛选。经筛选得到的基因用ScanProsite和InterProScan分析推测氨基酸的序列。构建针对新基因的原核表达载体,获得重组蛋白。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用间接荧光抗体技术对重组蛋白进行微小隐孢子虫卵囊或子孢子抗原定位,同时进行重组蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性试验。另构建重组真核表达质粒,将其转染Hela细胞后,经G418加压筛选获得亚克隆细胞株。用间接免疫荧光抗体及Westen-blot方法检测重组真核表达质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的蛋白及其反应原性。将真核重组质粒滴鼻注射免疫BALB/c小鼠及怀孕山羊(3-4个月),检测真核重组质粒的免疫保护性。试验结果表明:成功合成隐孢子虫双链cDNA,容量为1.3×10~ 13个DNA分子,在核糖体展示系统进行体外翻译。经筛选获得新的6个微小隐孢子虫粘附相关蛋白基因。选择开放阅读框长度为585bp,编码粘蛋白样的糖蛋白的基因作为疫苗的候选基因(命名为CP585)进行免疫保护性研究。本研究成功构建pET-28a-CP585原核表达载体,获得CP585的重组蛋白。经间接免疫荧光抗体试验证实CP585蛋白位于微小隐孢子虫卵囊壁表面和子孢子表膜。将纯化的重组蛋白免疫BALB/小鼠,诱导机体产生了特异的体液和细胞免疫应答。用1×10~6个微小隐孢子虫卵囊对小鼠进行攻虫感染,试验组与各对照组相比排出卵囊明显减少(P < 0.05),减虫率为47.78%。构建的真核重组质粒pVAX1-CP585,经检测可以在体外表达特异性蛋白质。用该重组质粒滴鼻免疫BALB/c小鼠,证实可诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,并能对微小隐孢子虫的感染有一定抵抗作用,减虫率达60.52%。用该重组质粒滴鼻免疫怀孕山羊(3-4个月),经检测山羊血清中有抗微小隐孢子虫特异性抗体,且CD4+/ CD8+比值升高。山羊的子代羔羊出生后人工灌胃感染1×10~6微小隐孢子虫卵囊,经检测pVAX1-CP585试验组比各对照组相卵囊排出量明显减少(P<0.05),减虫率为49.29%。说明免疫真核重组质粒山羊的母体中含有抗微小隐孢子虫特异性抗体,对其易感子代有一定的免疫保护力。本研究证实CP585基因可以作为微小隐孢子虫疫苗的候选基因。