背景胰腺癌是目前已知的恶性度最高的肿瘤之一,其发病率和病死率逐年增高。由于该病起病隐匿,病程进展迅速,早期诊断困难,其总体死亡率高,平均生存期为诊断后6个月,5年生存率仅为5%。基于传统治疗在胰腺癌中作用有限,为了改善疗效,降低药物毒性,靶向治疗药物为胰腺癌的治疗开辟了新的途径。其中靶向EGFR的治疗已显示出初步疗效,但仍对部分患者无效。EGFR受体信号通路在细胞增殖和分化的过程中起着重要作用,其信号分子基因的突变在肿瘤发展过程中具有重要作用。EGFR, KRAS, BRAF是该信号通路中的关键分子,其基因突变与该信号通路的激活及肿瘤的发展关系密切。RAS GAPs则通过增加RAS蛋白内在的GTPase活性,水解RAS GTP形成RAS GDP,关闭RAS信号通路,实施负调控作用。RASA1作为RAS GAPs中的一种,是RAS信号通路关键调节分子。它的表达缺失或下调也引起RAS信号通路的活化,但在胰腺癌中的作用及意义至今未见研究报道。目的通过检测胰腺癌中EGFR/KRAS信号通路中EGFR、KRAS、BRAF分子突变状况,及RASA1在胰腺癌细胞和组织中的表达,探讨它们在胰腺癌发病中可能的作用及其临床意义。为进一步阐明胰腺癌发生发展过程中的分子机制,以寻找胰腺癌诊断与治疗新靶点提供理论依据。方法1、收集2000年至2009年广东省人民医院手术切除组织石蜡标本胰腺癌32例,经经验丰富的病理科医生复习阅片后重新构建组织切片。所有患者术前均未进行放疗、化疗及其它抗肿瘤治疗,临床病理资料完整。另取胰腺囊肿5例,慢性胰腺炎5例组织标本作为对照。2、石蜡切片常规脱蜡／再水化,收集组织,用Qiagen公司QIAamp DNA FFPE Tissue kit提取基因组DNA：按说明书提示提取DNA。使用TaKaRa公司Premix Ex TaqTM Hot Start Version扩增EGFR18、19、21外显子片段,KRAS2、3外显子片段,BRAF15外显子片段：95℃5min--(95℃45s—58℃45s—72℃1min)x35个循环—72℃5mmin,12℃保温。采用优晶公司生产的凝胶回收试剂盒Ⅱ进行PCR产物的纯化：收集琼脂糖凝胶电泳目的条带,溶解,将溶液转移至Mu-PuDNA回收纯化柱上,离心弃滤液,SPW洗涤缓冲液洗涤柱子,洗脱DNA。以纯化后的PCR产物作为模板,使用美国ABI公司的BigDyeTerminator v3.1试剂盒进行测序PCR反应。96℃变性1min—(96℃变性10s—55℃褪火5s—60℃延伸4min)×25个循环—4℃保温,产物漂洗预变性后转移到96孔板,ABI公司生产的3100基因分析仪进行测序。3、采用Trizol(Life Technologies公司)提取细胞总RNA。通过逆转录获得cDNA,以GAPDH为内参,进行荧光定量PCR。在ABI-7500型荧光定量PCR仪上进行PCR反应。反应条件：95℃10min—(95℃30s—58℃30s—72℃30s)×50个循环。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线,利用实时荧光PCR仪自带软件进行分析,获得产物Ct值；并回收产物,进行琼脂糖凝胶电泳。RASA1mRNA的相对表达量采用2-ΔCt计算。4、以400μl100℃1×SDS裂解液裂解2×106个细胞,煮沸10min；4℃、20,000×g离心10min,取上清；BCA法测定蛋白浓度；调整浓度至1μg/μl,取20μl蛋白行SDS—PAGE电泳；将蛋白质转印到PVDF膜上；兔抗人RASA1多克隆抗体(Epitomics公司)1：1000稀释、兔抗人GAPDH单克隆抗体(CST公司)1：2000稀释,4℃孵育过夜;加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(CST公司)1：1500稀释,室温孵育1小时；ECL (Invitrogen公司)显色,曝光。BandScan5.0软件分析条带灰度进行统计学分析。5、采用免疫组化En Vision染色法检测RASA1蛋白表达。石蜡组织常规脱蜡水化；pH8.0Tris-EDTA液高温高压修复；3%H202室温孵育15min消除内源性过氧化物酶,PBS漂洗；兔抗人RASA1单克隆抗体(Lifespan公司)1：50稀释,室温孵育60min, PBS漂洗；羊抗兔En Vision试剂(上海基因公司)室温孵育35min, PBS漂洗；DAB显色,苏木精复染,脱水透明,树胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照,用已知表达阳性的人卵巢癌标本作为阳性对照。阳性细胞必须具备：①细胞结构清晰；②阳性颗粒定位准确；③着色明显高于背景,对比清楚。RASA1定位于细胞质。阳性染色为黄色,棕黄色或棕褐色。免疫组化结果根据阳性细胞染色强度判定：无着色为0分,淡黄色或黄色为1分,棕黄色或棕褐色为2分。6、采用SPSS13.0进行统计分析。对正态分布的连续性变量采用(x±s)描述,非正态分布的连续性数据采用中位数(四分位数间距)描述。采用四格表x2检验及Fisher精确概率法x2检验比较胰腺癌组织与胰腺良性病变组织中KRAS突变率差异。采用One-way ANOVA分析比较胰腺癌细胞株及正常胰腺细胞株中RASA1mRNA表达水平差异,采用SNK法比较组间差异；采用四格表x2检验比较RASA1蛋白在胰腺癌组织中表达水平与其各临床病理因素之间的关系,以及RASA1蛋白在胰腺癌组织及胰腺良性病变组织中的表达差异,采用两独立样本r检验比较胰腺癌患者中RASA1表达水平与年龄的关系。不满足正态分布的的数据采用两样本比较秩和检验(Wilcoxon两样本比较法)。P<0.05表示有统计学意义。结果1、胰腺组织中EGFR、KRAS、BRAF突变率所检测胰腺癌临床组织标本中未见BRAF突变。32例胰腺癌患者中有24例患者KRAS基因存在突变,突变率为75%。而胰腺良性病变中KRAS突变率为0,两者差异有统计学意义(P<0.05)。24例KRAS突变中包括22例12密码子突变(91.7%),其中14例GGT突变为GAT(G-D),8例突变为GTT(G--V)；2例61密码子突变(8.3%),CAA突变为CTA(Q--L)。13密码子未见突变。32例胰腺癌患者中3例存在EGFR突变(突变率为9.4%),其中包括1例19密码子突变,2例21密码子突变,10例良性病变组织未发现EGFR突变。2、胰腺细胞中RASA1mRNA和蛋白表达水平各胰腺癌细胞株中RASA1的mRNA和蛋白表达水平均低于正常的胰腺导管细胞(P<0.05)。KRAS野生型胰腺癌细胞中RASA1的mRNA和蛋白表达水平均低于KRAS突变型胰腺癌细胞(P<0.05)。3、胰腺组织中RASA1表达水平及其与临床病理特征的关系在组织中,胰腺癌中RASA1蛋白表达水平显著低于良性病变组织(P<0.05)；侵犯周边器官的肿瘤组织中RASA1表达显著低于局限于胰腺内的组织(P<0.05)；Ⅰ期胰腺癌组织RASA1的表达则显著高于Ⅱ、Ⅲ期的癌组织(P<0.05)；但RASA1表达与胰腺癌的远处转移关系不明确。结论1、国人胰腺癌中EGFR/RAS/MEK信号通路异常,部分可能与KRAS突变有关,少见EGFR突变,未见BRAF突变。2、RASA1作为抑癌基因在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用。