前言：　　甲基汞(methylmercury，MeHg)是严重危害人类健康的环境蓄积性污染物，具有强烈的神经毒性作用。MeHg脂溶性强，易于穿透生物膜，进入机体后主要与巯基结合，以半胱氨酸-甲基汞复合物的形式，在中性氨基酸的转运下透过血脑屏障在脑中蓄积。　　虽然人们致力于研究MeHg的神经损害多年，但其神经毒性机制仍未被完全阐明。有报道称MeHg的神经毒性主要与其所致脑氧化损伤及Glu代谢转运障碍有关，二者的相互作用又进一步增大了其神经毒性。有研究表明MeHg可使脑中ROS形成率显著升高，ROS是细胞过氧化损伤的起始因子，细胞内ROS生成增加以及抗氧化体系的抑制共同导致细胞氧化损伤。Glu在突触间隙中是通过受体的灭活与Glu的重摄取而达到平衡状态。Glu的重摄取依赖于星形胶质细胞上的谷氨酸转运体，重摄取进入星形胶质细胞的Glu会被GS转化为Gln，以保持突触间隙正常的Glu浓度。有研究提示MeHg可能会干扰Glu重摄取和代谢，而这种效应可能与MeHg导致的氧化损伤有关。此外，突触间隙内的Glu与突触后神经元的Glu受体（主要是NMDA受体）相结合，向下传导细胞信号。突触间隙内过量的Glu会过度激活NMDA受体，Ca2+大量内流。有研究提示神经元内Ca2+超载可能会通过一系列反应促使线粒体ROS生成增加从而加剧氧化损伤，但其机制还不是十分明确。　　茶多酚(tea polyphenols，TP)是一种天然抗氧化剂，其含有的大量酚羟基能够清除体内过量的活性氧自由基，抑制过氧化反应。盐酸美金刚胺(memantine，MEM)是一种低亲和力、非竞争性的NMDA受体拮抗剂，能够抑制NMDA受体过度激活而引起的Ca2+内流，在临床上可用于阿尔茨海默病的治疗。但是，目前应用TP和MEM预处理来拮抗MeHg神经毒性的研究还鲜有报道。　　本研究拟通过整体动物实验与体外细胞培养相结合的方法，首先建立MeHg短期重复暴露动物模型，研究MeHg致大鼠大脑皮质氧化损伤和Glu代谢转运障碍，以及TP和MEM的防护作用;其次，建立星形胶质细胞染毒模型，研究MeHg致星形胶质细胞氧化损伤和Glu代谢转运障碍，以及TP的防护作用;最后，建立神经元染毒模型，研究MeHg致神经元NMDA受体表达异常及钙超载，以及TP和MEM的防护作用，深入探讨MeHg所致氧化损伤与Glu代谢转运障碍介导的兴奋性毒性之间的联系，为MeHg中毒的防治提供实验依据。　　材料与方法：　　一、TP和MEM预处理对MeHg致大鼠大脑皮质氧化损伤及Glu代谢转运障碍的防护作用　　由中国医科大学实验动物中心提供的实验用清洁级Wistar大鼠180只，体重170±10克，雌雄各半，分为两个批次，每个批次90只。第一批大鼠按体重随机分为5组，每组18只。第1组为对照组，第2组为TP对照组，第3、4组分别为低、高剂量染汞组，第5组为TP预处理组。第1、3、4组灌胃生理盐水，第2、5组灌胃1mmol/kgTP。2h后，第1、2组腹腔注射生理盐水，第3、4、5组分别腹腔注射4、12、12μmol/kgMeHgCl，灌胃及注射容量均为5ml/kg。连续染毒与预处理4周，染毒每周5次，TP预处理隔日1次。第二批大鼠分组方式与第一批相同，第1、3、4组皮下注射生理盐水，第2、5组皮下注射5μmol/kgMEM。2h后，第1、2组腹腔注射生理盐水，第3、4、5组分别腹腔注射4、12、12μmol/kgMeHgCl。连续染毒与预处理4周，染毒每周5次，MEM预处理隔日1次。最后一次染毒24h后，每组取6只大鼠麻醉，处死，切取枕叶大脑皮质，应用冷原子吸收法测定大脑皮质内汞含量。其余大脑皮质根据检测指标的不同，制备成不同浓度的匀浆液，应用比色法测定大脑皮质GSH、MDA、protein sulfhydryl、protein carbonyl、Glu和Gln的含量，以及SOD、GSH-Px、GS、PAG、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活力。各组再取4只大鼠，制备大脑皮质单细胞悬液，应用流式细胞术测定大脑皮质细胞内ROS含量及细胞凋亡率、双波长荧光比色法测定游离Ca2+浓度。各组另取4只大鼠，提取大脑皮质总RNA及蛋白，应用Real-time PCR及Western blotting法检测Nrf2及其下游基因和蛋白（HO-1和γ-GCS）、NMDA受体(NR1、NR2A、NR2B)及谷氨酸转运体（GLAST和GLT-1）mRNA和蛋白表达水平。各组其余4只大鼠，麻醉后暴露心脏，4％多聚甲醛灌流固定后取大脑皮质，免疫组化法检测8-OHdG含量，HE染色及透射电镜观察组织细胞病理学改变。　　二、TP预处理对MeHg致大鼠大脑皮质星形胶质细胞氧化损伤及Glu代谢转运障碍的防护作用　　进行星形胶质细胞原代及传代培养，应用GFAP免疫细胞化学反应进行鉴定，阳性率达90％以上后进行实验。通过MTT法测定细胞活力以及LDH漏出分析，观察MeHg(0～20μmol/L)处理6～30h后细胞毒性的变化和TP(50～400μmol/L)预处理1～12h后的防护作用，并选择适宜且有代表性的MeHg处理和TP预处理的剂量和时间，进行星形胶质细胞形态学观察，并应用前述方法测定细胞内NPSH含量，ROS、Ca2+及细胞凋亡水平，GS和Na+-K+-ATPase活力，Nrf2及其下游基因蛋白HO-1、γ-GCS的mRNA和蛋白表达水平，GS、GLAST及GLT-1的mRNA和蛋白表达水平。　　三、TP和MEM预处理对MeHg致大鼠大脑皮质神经元NMDA受体表达异常及钙超载的防护作用　　进行原代神经元培养，应用NSE免疫荧光染色进行鉴定，阳性率达90％以上后进行实验。通过MTT法及LDH漏出分析法，观察MeHg（0～2μmol/L）处理0.5～12h后细胞毒性的变化，以及TP(5～40μmol/L)和MEM(2.5～20μmol/L)预处理0.5～6h后的防护作用，并选择适宜且有代表性的MeHg处理、TP和MEM预处理的剂量和时间，进行神经元形态学观察，并应用上述方法测定NMDA受体(NR1、NR2A和NR2B)的mRNA和蛋白表达水平、细胞内游离Ca2+含量、钙蛋白酶活力、ROS水平、Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活力。　　结果：　　一、TP和MEM预处理对MeHg致大鼠大脑皮质氧化损伤及Glu代谢转运障碍的防护作用　　与对照组相比，随着染MeHg剂量的增加，大鼠大脑皮质内Hg含量逐渐升高，GSH含量、SOD和GSH-Px活力、protein sulfhydryl含量逐渐降低，细胞内ROS水平逐渐升高，MDA、protein carbonyl及8-OHdG含量逐渐升高，Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活力逐渐降低，Nrf2、HO-1及γ-GCSmRNA和蛋白表达水平逐渐升高，Glu含量逐渐升高，Gln含量逐渐降低，GS活力逐渐降低，PAG活力逐渐升高，NMDA受体mRNA和蛋白表达水平逐渐下降，GLAST和GLT-1mRNA和蛋白表达水平逐渐降低，细胞内游离Ca2+含量和细胞凋亡水平逐渐升高，大脑皮质组织形态及细胞超微结构损伤程度逐渐加重。与12μmol/kgMeHg组比较，TP和MEM预处理后，大脑皮质氧化损伤及Glu代谢转运障碍得到不同程度的缓解，大脑皮质组织及细胞损伤程度减轻，但大脑皮质内Hg含量未见显著性降低。　　二、TP预处理对MeHg致大鼠大脑皮质星形胶质细胞氧化损伤及Glu代谢转运障碍的防护作用　　通过MTT法和LDH漏出分析观察MeHg对星形胶质细胞是否具有毒性作用。结果表明随着MeHg处理剂量和时间的增加，星形胶质细胞活力逐渐下降，LDH漏出逐渐增加，并呈现一定的剂量和时间依赖性的效应关系。在10μmol/LMeHg剂量水平上，处理24h后，相对细胞活力为52.3％，大约达到半数抑制浓度，给予不同浓度及时间的TP预处理后，通过MTT法及LDH漏出分析，发现与10μmol/LMeHg组比较，在200和400μmol/LTP预处理6和12h后，星形胶质细胞活力显著升高，LDH漏出显著降低，且两个剂量之间以及两个处理时间之间未见明显差异，故在后续实验中我们选择10μmol/LMeHg处理24h作为MeHg处理剂量和时间，选择50、100和200μmol/L三个剂量组预处理6h作为TP预处理剂量和时间。与对照组相比，10μmol/LMeHg组星形胶质细胞出现严重的形态学损伤，细胞内NPSH含量显著降低，ROS水平显著升高，GS及Na+-K+-ATPase活力显著降低，细胞内Ca2+水平显著升高，细胞凋亡水平显著升高，Nrf2、HO-1及γ-GCSmRNA和蛋白表达水平均显著升高，GS、GLAST及GLT-1mRNA和蛋白表达水平均显著降低。与10μmol/LMeHg组相比，随着TP预处理剂量的升高，上述损伤均得到不同程度的缓解，并呈现一定的剂量效应关系。　　三、TP和MEM预处理对MeHg致大鼠大脑皮质神经元NMDA受体表达异常及钙超载的防护作用　　通过MTT法和LDH漏出分析观察MeHg对神经元是否具有毒性作用。结果表明随着MeHg处理剂量和时间的增加，神经元细胞活力逐渐下降，LDH漏出逐渐增加，并呈现一定的剂量和时间依赖性的效应关系。我们采用与星形胶质细胞相同的方法，确定1μmol/LMeHg处理6h（细胞活力为53.15％）为MeHg的暴露剂量和时间，5、10、20μmol/LTP预处理3h，2.5、5、10μmol/LMEM预处理3h分别为TP和MEM的预处理剂量和时间。与对照组相比，1μmol/LMeHg组神经元出现严重的形态学损伤，NR1、NR2A和NR2BmRNA表达水平均显著升高，NR1和NR2A蛋白表达水平显著升高，细胞内游离Ca2+含量显著升高，钙蛋白酶活力显著升高，ROS水平显著升高，Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力显著降低。与1μmol/LMeHg组相比，随着TP和MEM预处理剂量的增加，神经元损伤及细胞毒性得到不同程度的减轻，并呈现一定的剂量效应关系。　　结论：　　1、MeHg可导致大鼠大脑皮质氧化损伤和Glu代谢转运障碍，TP和MEM预处理对其具有一定程度的保护作用。　　2、MeHg可对星形胶质细胞产生毒性作用，并能够导致星形胶质细胞氧化损伤和Glu代谢转运障碍，TP预处理能够减轻这种损伤。　　3、MeHg可对神经元产生毒性作用，导致NMDA受体表达异常，细胞内钙超载，并加剧神经元氧化损伤，TP和MEM预处理对其具有一定的防护作用。