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由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病是亚热带和温带稻区最重要的病毒病之一。在我国的粳稻产区一般会造成20%-30%的损失,特别是近年来已上升为影响范围最广、危害最大的一种水稻病毒病。水稻条纹病毒外壳蛋白(CP)是一种与症状密切相关的蛋白,本文利用PCR扩增获得水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽基因和RSV CP基因,分别借助于pGEX-4T-1和pET-29a表达载体,构建了二者的融合基因PR-CP和PR-S-CP,并根据农杆菌EHA105菌株介导法转化水稻的需要,分别将RSV CP与PR-CP连接到水稻转化常用载体pTCK303,通过转基因手段初步研究水稻叶绿体引导肽在RSV致病过程中所起的作用,为进一步探究RSV的致病机理打下基础。
利用农杆菌EHA105菌株的介导,将构建的植物表达载体转入水稻模式品种日本晴的成熟愈伤组织。对转化体系的研究表明,NB培养基中2.3mg/L的2,4-D的使用促进了愈伤组织的分生能力,在分化培养基中加入10mg/L的KT和0.5mg/L的NAA,提高了愈伤组织的分化效率,农杆菌培养液中100μM As(乙酰丁香酮)的加入有效地诱导了农杆菌Vir基因的活化,从而促进了外源基因的整合并使转化效率得到提高。利用PCR方法对转化得到的水稻进行目的基因检测,确定获得T0代转基因水稻27株(其中转CP基因苗12株,转PR-CP基因苗15株)。收获转基因植株T1代种子,在含潮霉素(30mg/L)的NB培养基中,20天后观察其发芽情况,发现T1代种子中,抗性和敏感性种子按3:1的比例分离,说明了整合入T0代基因组的目的基因向T1代的稳定遗传。从转基因苗的表型症状上看,转CP基因植株在农艺性状上与对照差异不大,转PR-CP基因植株则有明显的矮化、生长缓慢症状,说明进入叶绿体的CP会对水稻的正常生理产生了一定的影响。