一、研究背景溃疡性结肠炎是一种病变部位主要位于结肠及直肠的慢性非特异性炎症反应。临床治疗多以抗炎、调节免疫为主。近年研究发现,肠道损伤后,除炎症损伤因素外,修复因素在病程的发展中同样具有非常重要的作用,两者的相互作用决定了UC病情的转归,许多生长因子参与肠黏膜修复过程。随着研究的发展,一些生长因子新制剂已逐渐应用于炎症损伤的治疗,并且取得不错的效果。肠三叶因子(ITF)是近年发现的一种由肠道杯状细胞分泌新型细胞生长因子,与其它肠道保护修复因子(MUC-2、EGF、TGF-α等)可一起共同作用,具有很强的细胞保护作用,可明显减轻多种损伤因子介导的肠黏膜损伤。因此,研究中药复方对这些特异保护因子的调节作用,有望为UC治疗提供新的思路。经验方溃结灵以清热健脾活血为治则,临床研究表明其对UC疗效较好。前期研究采用三硝基苯磺酸灌肠复制UC大鼠模型,发现溃结灵可明显减轻UC大鼠肠黏膜炎症反应,可下调炎症因子如Toll样受体、IL-1β、TNF-α、NF-κB等的表达,改善肠黏膜超微结构,上调造模3、7、14天模型大鼠肠黏膜ITFmRNA、MUC-2蛋白的表达及14天TGF-α和pERK1/2的蛋白表达；对UC血清致Caco-2细胞损伤模型的研究发现,溃结灵含药血清可促进Caco-2细胞损伤模型细胞增殖,增加ITF基因、MUC-2蛋白的表达以及上调pERK、pMEK蛋白的表达。本研究拟继续从促黏膜修复角度入手,观察溃结灵含药血清对大鼠结肠上皮细胞ITF表达及其信号转导通路相关蛋白ERK、MEK磷酸化变化的影响,进一步探讨溃结灵治疗UC的作用机理,和前期的实验互为佐证。二.研究方法与结果1.原代大鼠结肠上皮细胞分离培养方法的建立原代大鼠结肠上皮细胞来源于正常大鼠结肠组织,能真实反映机体生理和病理变化,然而分离培养技术是一个难题,限制了其应用。在参考国内外文献的基础上,本研究建立了大鼠原代结肠上皮细胞分离培养方法。可为结肠上皮形态及功能研究提供理想的细胞模型。方法：采用6-15日龄乳鼠,取结肠剪碎、反复清洗后,弃上清,加10ml、0.1%Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶联合配制的消化液,37℃消化25min,分离上皮细胞团；吹打消化液,取上清,加入培养基重悬反复离心3次后,细胞沉淀接种于含10%胎牛血清的完全培养基中,37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。采用差速贴壁法及相差消化法去除成纤维细胞,细胞贴壁长满瓶80%-90%后用2.5g/L的胰酶消化液消化并传代。结果：成功分离结肠上皮细胞团且活力较高。24h后可见部分细胞团贴壁,贴壁细胞为多角形,4-8d逐渐融合成片,呈现明显的“铺路石”样。细胞经传代处理后成纤维细胞明显减少。第2代细胞在生长过程中逐渐生长成性似IEC-6上皮细胞,状态较好,增殖较快。细胞经免疫荧光染色及透射电镜观察鉴定为上皮细胞。冻存处理复苏后细胞状态较佳。2.大鼠结肠上皮细胞ITF/EGF、MUC-2/TGF-α及pERK/pMEK表达的研究胃肠黏膜保护及促修复因子ITF、MUC-2、EGF、TGF-α在肠黏膜损伤修复及肠黏膜屏障重建过程中具有重要的作用。本研究对结肠上皮细胞是否有以上生长因子的表达进行了检测。为后续开展药物对肠上皮细胞作用的指标选择提供基础及参考。方法：采用荧光定量PCR (Real-Time PCR)检测结肠上皮细胞ITF、EGFmRNA的表达；采用Elisa的方法检测MUC-2/TGF-α蛋白表达；采用Western bolt方法检测pERK/pMEK蛋白表达。结果：结肠上皮细胞表达ITF/EGFmRNA、MUC-2/TGF-α蛋白及pERK/pMEK蛋白。可用于肠黏膜损伤修复的相关实验研究。3.溃结灵含药血清对UC模型血清致损的结肠上皮细胞超微结构的影响本课题整体实验研究发现,溃结灵可明显减轻TNBS灌肠复制的UC大鼠的炎症反应,可促进肠道上皮杯状细胞的分泌,减轻结肠组织超微结构损伤,进而促进肠黏膜修复及重建。本实验在此基础上,观察溃结灵含药血清对UC大鼠血清致结肠上皮细胞损伤模型细胞超微结构的影响。进一步从细胞形态学方面探讨溃结灵的作用。方法：三硝基苯磺酸灌肠法复制溃疡性结肠炎大鼠模型,3天后腹主动脉采血,分离获取血清,作为损伤剂作用结肠上皮细胞24h模拟细胞损伤模型,透射电镜法观察结肠上皮细胞超微结构的改变。结果：正常对照组及空白对照组细胞可见丰富的微绒毛,有的呈小片状。细胞内可见丰富的线粒体,还可见核糖体、内质网及高、中、低等电子密度分泌颗粒；UC模型血清造模组可见较少微绒毛,胞质内可见粗面内质网扩张,少量线粒体及线粒体肿胀,空泡样变甚至溶解,有大量的胞质内空泡形成,微绒毛较少或消失,分泌颗粒较少,为中低等电子密度。给予溃结灵含药血清组细胞形态较好,细胞微绒毛及线粒体等细胞器丰富,可见较多高、中、低等电子密度分泌颗粒。4.溃结灵含药血清对正常大鼠结肠上皮细胞增殖的影响结肠上皮细胞在肠黏膜损伤修复中具有重要的作用,UC发病时,促进结肠上皮细胞的增殖、移行、分化,可加速受损黏膜的修复以及肠黏膜屏障功能的恢复。本实验采用溃结灵含药血清干预结肠上皮细胞,探讨溃结灵含药血清对结肠上皮细胞增殖的影响。方法：采用血清药理学方法制备溃结灵含药血清；MTT法测定溃结灵含药血清干预大鼠结肠上皮细胞12、24、48h后细胞增殖情况。结果：空白大鼠血清对大鼠结肠上皮细胞(CEC)生长无影响,溃结灵中剂量(5%含药血清)作用24h、48h均明显促进CEC增殖(p<0.05)5.溃结灵含药血清对TNF-α致结肠上皮细胞损伤模型细胞增殖的影响TNF-α为公认的UC致病因子,是肠道上皮细胞增殖和凋亡的主要促炎因子,UC发病时,TNF-α大量分泌,可使结肠上皮细胞凋亡,肠黏膜屏障的通透性增加,NF-κB被激活,进一步扩发炎症反应,损伤肠黏膜。本实验观察不同浓度TNF-α对大鼠上皮细胞增殖的影响,以确定TNF-α合适的作用浓度及作用时间建立结肠上皮细胞损伤模型,并测定溃结灵含药血清对TNF-α干预下结肠上皮细胞增殖的情况,从细胞增殖的方面,进一步探讨溃结灵对受损结肠上皮细胞的保护作用。方法：以25,50,100,150,200ng/ml的TNF-α干预结肠上皮细胞,MTT法测定不同干预时间(3h,6h,24h)细胞的增殖情况,同法测定预先给予溃结灵含药血清对50ng/mlTNF-α干预结肠上皮细胞6h细胞增殖的影响。结果：①50ng/ml TNF-α干预结肠上皮细胞6h后可明显抑制细胞增殖(p<0.05)；②24h时,各浓度TNF-α均明显抑制结肠上皮细胞增殖(p<0.01)③与模型组比较,溃结灵含药血清各剂量组均有一定的促进TNF-α干预下结肠上皮细胞增殖的作用,但无统计学意义(p>0.05)。6.溃结灵含药血清对TNF-α干预下大鼠结肠上皮细胞ITF、EGFmRNA表达的影响ITF、EGF在胃肠道上皮保护和促进黏膜愈合方面发挥着重要的作用,与UC的修复愈合关系密切。本研究观察溃结灵含药血清对TNF-α干预下结肠上皮细胞EGF及ITFmRNA表达的影响,以进一步在离体细胞水平探讨溃结灵促进肠黏膜损伤修复的作用靶标。方法：以50ng/mlTNF-α干预结肠上皮细胞6h,造成细胞损伤模型,采用荧光定量PCR (Real-Time PCR)法检测不同浓度溃结灵含药血清对此细胞损伤模型ITF及EGFmRNA的表达的影响。结果：①模型组EGF、ITFmRNA表达较空白对照组减低；②溃结灵各剂量组(?)GFmRNA相对表达量与模型组相比,无统计学意义(p>0.05)；③溃结灵高(10%含药血清)、中剂量组(5%含药血清)ITFmRNA表达量明显高于模型组(p<0.05,p<0.01)。7.溃结灵含药血清对TNF-α干预下大鼠结肠上皮细胞MUC-2、TGF-α蛋白表达的影响MUC-2、TGF-α在黏膜保护和肠道疾病修复机制中占有重有地位,且在肠道黏膜修复中MUC-2、TGF-α、EGF、与ITF具有协同作用,保护和促进黏膜修复。本研究进一步观察了溃结灵含药血清对TNF-α干预下结肠上皮细胞MUC-2及TGF-α蛋白表达的影响,探讨溃结灵促进肠黏膜损伤修复的又一可能作用靶标,以进一步揭示溃结灵治疗UC的分子作用机理。方法：TNF-α(50ng/ml)干预结肠上皮细胞生长6h造成结肠上皮细胞损伤模型,采用Elisa方法检测不同浓度溃结灵含药血清对此细胞损伤模型MUC-2及TGF-α蛋白含量的影响。结果：①TNF-α作用于细胞后,与空白对照组比较,模型对照组MUC-2含量增加(p<0.01), TGF-α含量降低,但无统计学差异；②与模型对照组比较,溃结灵含药血清高剂量组MUC-2含量增加(p<0.05),溃结灵含药血清高剂量组TGF-α含量显著升高(p<0.01)。8.溃结灵含药血清对TNF-α干预下大鼠结肠上皮细胞pERKl/2、pMEK1/2蛋白表达的影响ERK信号转导通路参与调节细胞的增生、分化、凋亡等过程。其在真核细胞内广泛存在,许多因子通过ERK通路发挥作用。而细胞信号中传递丝裂原信号的关键激酶是胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2), ERK被激活后,可诱导细胞产生分裂、增殖等效应。本研究观察溃结灵含药血清对结肠上皮细胞损伤模型pERK1/2、pMEK1/2蛋白表达的影响。以期进一步揭示溃结灵治疗UC的作用机理。方法：TNF-α(50ng/ml)干预结肠上皮细胞生长6h造成结肠上皮细胞损伤模型,提取细胞全蛋白,采用WesternBlot法检测溃结灵含药血清对此上皮细胞损伤模型pMEK1/2, pERK1/2蛋白表达水平的影响,内参蛋白为β-actin,目的蛋白的相对含量为目的蛋白与β-actin密度的比值,结果进行组间比较分析。结果：①50ng/ml TNF-α作用于结肠上皮细胞6h后,细胞内pMEK1/2、pERK1/2蛋白表达均有增加；②溃结灵高剂量(10%含药血清)、中剂量(5%含药血清)明显促进pMEK1/2蛋白表达(p<0.05),溃结灵中剂量(5%含药血清)明显促进pERK1/2蛋白表达(p<0.05)。提示溃结灵含药血清对TNF-α法干预下结肠大鼠上皮细胞pERK1/2、 pMEK1/2蛋白表达有上调作用,ERK信号通路可能是溃结灵保护及修复肠黏膜损伤的转导途径之一三、研究结论1.本研究建立了大鼠结肠上皮细胞原代培养体系,为结肠上皮生理、病理及药物作用机制提供了体外研究平台。对研究肠上皮细胞与炎症性肠病病因学的相关性及其中药对炎症性肠病的防治具有重要的意义。2、本研究结果显示,结肠上皮细胞表达ITFmRNA, EGFmRNA, MUC-2、TGF-α蛋白,ITF,MUC-2由肠道杯状细胞分泌,证明,此细胞可用于肠黏膜损伤修复的相关实验研究。3.溃结灵含药血清能够促进正常大鼠结肠上皮细胞的增殖,改善UC大鼠血清致结肠上皮细胞损伤模型的超微结构,对TNF-α干预下的结肠上皮细胞具有一定的促增殖作用。提示,促进结肠上皮细胞增殖是该方的疗效机理之一4.溃结灵含药血清能上调TNF-α干预下的结肠上皮细胞ITF基因、MUC-2、TGF-α蛋白表达以及pERK1/2、pMEK1/2蛋白表达。提示,溃结灵可通过激活ERK通路,促进上皮细胞的增殖移行,进而加速肠黏膜损伤修复。也可能是其作用的分子机制之一