目的：　　 生理状态下,血管生成促进因子和抑制因子处于动态平衡,共同参与调节体内的血管生成,而在肿瘤形成等病理状态下,这种平衡被破坏,血管生成促进因子占优势,肿瘤血管得以生成,肿瘤得以生长。近年来,利用血管生成抑制因子来抑制肿瘤血管生成,从而达到治疗肿瘤目的已成为研究的热点。内皮抑素是一种内源性血管内皮细胞抑制因子,能有效抑制血管生成,其在血管依赖性肿瘤的治疗中将发挥不可替代的作用,但其在体内含量甚微,且提取困难。因此,中国学者研制了一种重组人内皮抑素制剂——恩度(Endostar),目前恩度已经得到SFDA认可,临床用于治疗非小细胞肺癌,但它的作用机制尚不明确[1,2]。　　 磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号转导通路参与调节细胞的生存和凋亡,活化的Akt可磷酸化Bad、caspase9,活化NF-κB,从而发挥抗凋亡的作用。　　 细胞外信号调节激酶ERK是分裂原活化蛋白激酶MAPK信号传导通路的家族成员之一,调节细胞外信号向细胞内的传递,与细胞的分化、增殖和凋亡关系密切,已有多项研究表明其与肿瘤的发生、恶变及血管生成有关[3]。　　 Cbl-b和c-Cbl是泛素连接酶Ring-finger家族的两个成员,二者具有高度同源性,因参与胸腺细胞生成和T细胞的活化等免疫过程而被人们所认识,但近年来越来越多的研究表明,它们在胃癌等恶性肿瘤中被高表达,参与调节肿瘤细胞的生长、凋亡和肿瘤血管生成等。新近研究表明,Cbl-b作为PI3K的上游分子,促进了PI3K的调节亚单位p85的泛素化,进而影响PI3K下游的细胞凋亡和周期相关蛋白的表达,参与细胞增殖和凋亡等过程[4,5]。　　 为了进一步明确恩度的抗肿瘤血管生成能力和作用机制,本实验对恩度对肿瘤上清液诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖和凋亡的影响及p-Akt、p-ERK、c-Cbl及Cbl-b在恩度作用过程中的作用进行了探讨。　　 材料与方法：　　 一、细胞培养　　 HUVECs购自中国科学院上海细胞库,用含20％灭活胎牛血清的DMEM培养基培养,37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱孵育,每日换液一次,2-3日传代一次,用0.125％的胰蛋白酶消化细胞。　　 二、肿瘤上清液的制备　　 培养肾癌ACHN细胞,当其融合达80％时换以无血清DMEM培养基,继续培养24小时,离心收集上清液,将其与DMEM培养液以1:4的比例混匀备用。　　 三、实验分组　　 对照组(恩度浓度为Oμg/ml)、实验组(恩度浓度为25μ/ml,50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml)。　　 四、四甲基偶氮唑蓝还原反应(MTT)法检测细胞活力　　 五、Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡　　 六、Western blot检测Cbl-b,c-Cbl,p-Akt和p-ERK蛋白的表达　　 七、统计学处理:　　 每项实验重复3次,采用SPSS13.0软件进行统计分析。实验数据用平均数士标准差表示,多组均数比较用方差分析,相关性比较采用Pcarson分析方法。　　 实验结果：　　 恩度以浓度依赖性方式抑制肿瘤上清液诱导的HUVECs增殖,恩度浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml时,HUVECs的抑制率分别为11.83％、25.75％、40.37％及51.74％,实验组与对照组比较,差异具有统计学意义,恩度浓度与HUVECs的抑制率呈正相关(P＜0.05,R=0.963)。　　 恩度作用于肿瘤上清液诱导的HUVECs24小时后,呈浓度依赖性促进了HUVECs的凋亡。恩度浓度为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml时,HUVECs的凋亡率分别为5.45％、6.83％、7.19％、10.75％及12.8％,实验组与对照组比较,差异具有统计学意义,恩度浓度与HUVECs的凋亡率呈正相关(P＜0.01,R=0.972)。　　 恩度于肿瘤上清液诱导HUVECs24小时后,Cbl-b、p-Akt、c-Cbl及p-ERK蛋白的表达均被下调。当恩度浓度为0(对照组)、25、50、100、200μg/ml时,Cbl-b的表达率分别为89.2％、80.9％、52.9％、19.8％及16.7％;p-Akt的表达率分别为46.7％、37.7％、35.6％、28.1％及26.2％;c-Cbl的表达率分别为89.4％、70.9％、58％、34.8％及16.8％;p-ERK的表达率分别为82.7％、74.6％、64.1％、26.5％及19.3％。以上四种蛋白的表达随恩度浓度升高逐渐降低,实验组与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05)。同时,HUVECs增殖抑制率及凋亡率的变化趋势与Cbl-b、p-Akt、c-Cbl及p-ERK蛋白表达的变化趋势相一致。此结果提示,泛素连接酶Cbl-b和c-Cbl,以及p-Akt、p-ERK参与恩度抑制HUVECs增殖和促进其凋亡的作用过程。　　 结论：　　 恩度抑制肿瘤上清液诱导的HUVECs的增殖,恩度促进肿瘤上清液作用下的HUVECs凋亡,并且恩度在抑制HUVECs增殖和促进其凋亡的过程中下调Cbl-b、c-Cbl、p-Akt及p-ERK蛋白表达。