背景鬼臼毒素(Podophyllotoxin, PPT)是从小蘖科鬼臼属植物中提取的一种具有显著细胞毒性的天然活性物质。0.5% PPT酊剂是WHO推荐治疗尖锐湿疣(condyloma acuminatum, CA)一线药物之一。但PPT酊剂在皮肤局部停留时间短,药物浓度很快下降,并且对局部组织具有较强的刺激性,易引起皮肤溃烂等不良反应,当大面积使用时易产生系统吸收毒性。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是近年皮肤靶向性药物载体研究的热点,被认为是可替代脂质体的新一代药物载体。SLN制剂具有生理相容性好、可控制药物释放、良好的靶向性、可避免化学不稳定性药物的降解和减少药物对皮肤的刺激作用等多项优点。因此,SLN作为药物载体应用于经皮给药系统具有良好的发展前景。为了增加PPT在皮肤中的滞留量,增强其对病变组织的靶向作用,延长其对病变细胞的作用时间,达到提高CA的治疗效果同时又尽可能降低其局部和全身毒副作用的目的,我们以毒性低、生物相容性好的固体脂质材料—硬脂酸、十八烷酰胺为药物载体吸附或包裹PPT,以Brij78和大豆卵磷脂为混合表面活性剂,采用改良的乳化蒸发-低温固化法制备了鬼臼毒素固体脂质纳米粒(PPT-SLN)混悬液。凝胶具有很多优点,如良好的生物黏附作用；充分的三维空间网络结构,可均匀分散固体脂质纳米粒混悬液,进一步巩固稳定性；能够起到缓释长效目的等。所以我们进一步制备了鬼臼毒素-固体脂质纳米粒凝胶。为了证明鬼臼毒素固体脂质纳米粒凝胶的优越性,我们用传统的鬼臼毒素酊剂进行比较。皮肤病的治疗要求药物在皮损局部靶组织发挥作用,因此检测皮损内的药物浓度显得尤为重要。皮损内药物浓度不仅是皮损局部药效作用重要的定量指标,而且是进行皮肤药代动力学研究的关键参数。长久以来,外用制剂的皮肤内浓度检测因受到研究方法和分析设备的限制,应用和研究现状显得十分滞后。目前常用的评价药物透皮吸收的方法还是经典的两室Franz扩散方法,所用材料为离体动物/人体皮肤或人工膜。虽然Franz扩散池法在前期预测药物生物利用度或等效性方面不失为一种有效的方法,但是该方法还是有很多不足之处。其中最关键的是没有考虑到体内的血管系统、代谢酶及离体皮肤水分的丢失等问题。因此体外透皮研究结果不能准确反映药物在皮肤中的吸收、分布、代谢、转归等局部药代动力学过程。常用的体内评价药物经皮吸收方法,包括胶带剥离法、示踪技术、吸疱实验、皮肤活检等,不是特异性不高就是具有创伤性,未能达到微创、实时、精确定位等要求。微透析(microdialysis, MD)是一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术。可以用于在体监测外源性物质或内源性物质在组织细胞外液浓度随时间动态变化的过程。它以透析原理作为取样的基础,模拟了毛细血管能够容许细胞内外液物质自由扩散的功能。由于具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点,最近十几年来微透析技术在评价药物经皮代谢中受到广泛关注。经皮微透析可以对实验动物或人体皮肤组织进行在体、连续的药物浓度测定,使得在体研究外用制剂的经皮吸收动力学和生物等效性成为可能。皮肤药物代谢动力学的深入研究会有助于改善药物治疗方案,开发药物新剂型。另外,经皮给药后,药物可经皮吸收入血,利用血液微透析技术可以进一步评价外用药物系统吸收毒性。微透析取样的样品浓度低、样品体积小,因此微透析采样技术的可行性实质上依赖于检测仪器的选择,只要检测手段的灵敏度足够高,采用微透析技术是完全可行的。液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)方法具有灵敏度高、特异性强、样品量需求少、分析速度快的特点,其与微透析联用对生物活体的在线研究有不可替代的作用。因此,LC-MS/MS与微透析系统联用已经成为生物化学和药代动力学研究的重要方法之一。本研究以灵敏度高、特异性强的LC-MS/MS检测微透析样品中鬼臼毒素浓度,并对微透析取样过程中各种影响因素进行了考察和优化。在此基础上利用皮肤、血液同步微透析技术原位、在体、实时检测了鬼臼毒素-固体脂质纳米粒凝胶及鬼臼毒素酊剂在大鼠腹部经皮给药后,在大鼠皮肤、血液中鬼臼毒素浓度随时间变化规律,并进行生物等效性评价。目的1、建立测定大鼠皮肤及血液微透析样品中鬼臼毒素浓度LC-MS/MS法并进行方法学考察；2、考察鬼臼毒素微透析体内外回收率及影响因素；3、考察PPT-SLN凝胶经皮药代谢动力学及血液中药代动力学,并与鬼臼毒素酊剂进行生物等效性评价。方法1、微透析样品中加入依托泊苷为内标(internal standard, IS),经乙酸乙酯液-液提取后进行超高流速液相色谱串联质谱(ultra flow liquid chromatography tandem mass spectrometry, UFLC-MS/MS)测定。以乙腈-10mmol/L乙酸铵(40：60,v/v)为流动相,采用Agilent Zorbax XDB-C18色谱柱(2.1mm×50mm,3.5μm)进行分离,柱温为室温。流速为0.3mL/min;质谱采用正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(multi-reactions monitoring, MRM)。2、体外微透析试验中考察灌注液灌流速度、探针周围溶液温度、探针周围溶液浓度对探针相对回收率的影响,并以零净流量法(zero net flux method,ZNF)考察了鬼臼毒素通过微透析膜是否存在扩散方向依赖性。在大鼠右颈静脉及皮下植入探针后,以反向透析法分别测定鬼臼毒素在血液中及皮下回收率。以UFLC-MS/MS法检测微透析样品中药物浓度。3、8只雄性SD大鼠按完全随机的方法均分为两组,大鼠麻醉后,分别在腹部皮下和右颈静脉植入微透析探针,以1ul/ml速度灌流微透析探针,平衡一个小时后,在腹部分别给予PPT-SLN凝胶或者PPT酊剂。采样间隔时间为0.5小时,共收集10个小时。微透析样品以乙酸乙酯液-液提取后以UFLC-MS/MS法检测鬼臼毒素浓度。4、统计分析：药代动力学参数用DAS2.1.1版药动学分析软件处理。利用SPSS13.0软件对数据进行统计分析,计量资料数据用X±S表示,两组间均数比较采用两独立样本t检验(Independent-Samples T Test);分析各处理方式的主效应及交互效应采用重复测量的方差分析(Repeated measure);多组组间显著性检验采用单因素方差分析(One-Way ANOVA), P<0.05时差异有统计学意义。结果1、UFLC-MS/MS法用于定量分析的离子对分别为m/z 432.7→397.3(鬼臼毒素)和589.5→229.5(依托泊苷,IS)。标准曲线在2.0-1000ng/mL范围内有良好线性,相关系数均大于0.99,最低定量限(lowest limit of quantification, LLOQ)及最低检测限(lowest limit of detection, LOD)分别为2.0ng/mL0.7ng/mL。日内和日间精密度(RSD%)及准确度(RE%)均小于10%。2,体外微透析试验中,药物的回收率随灌注液流速的增大而减小,随温度的增加而增加,药物回收率与周围溶液中药物的浓度无关。ZNF法测定药物的回收率和传递率一致,回收率为47.89%；反向透析法测定皮下及血液中药物的回收率分别为(28.46±2.42)%,(15.61±1.92)%,且在10小时内基本稳定。3、PPT-SLN凝胶给药后血液微透析样品中检测不到药物浓度。皮肤下鬼臼毒素浓度重复测量的方差分析显示不同药物间的主效应差异有统计学意义(F=255.822,P=0.000),用药后不同时间的主效应差异有统计学意义(F=85.98,P=0.000)。用药后不同时间点与两组药物之间的交互效应差异也有统计学意义(F=14.362,P=0.000)。皮肤下鬼臼毒素浓度不同时间点PPT-SLN凝胶和PPT酊剂之间两独立样品t检验显示除0.5小时差异没有统计学意义外(t=1.794,P=0.123),其余各个时间点差异均有统计学意义(P<0.05),PPT酊剂组的皮肤下鬼臼毒素浓度均高于PPT-SLN凝胶组。对两组药物皮肤下主要药物代谢动力学参数两独立样本t检验示Tmax (t=2.777, P=0.032), Cmax (t=-7.806, P=0.000), AUC0-10h (t=-16.361, P=0.000), AUC0-∞(t=-4.841, P=0.003)差异均有统计学意义。PPT-SLN凝胶的皮肤下Cmax, AUC0-10h,AUC0-∞均低于PPT酊剂的Cmax, AUC0-10h, AUC0-∞。PPT-SLN凝胶的皮肤下Tmax高于PPT酊剂Tmax。结论1、UFLC-MS/MS测定大鼠皮肤下及血液微透析样品中鬼臼毒素浓度具有灵敏度高、专属性强的特点。2、PPT通过微透析膜不存在扩散方向依赖性,反向透析法可作为体内微透析研究中鬼臼毒素回收率的测定方法。3、鬼臼毒素-固体脂质纳米粒凝胶可对鬼臼毒素的经皮吸收起到良好的缓释作用,靶向性强,系统吸收毒性低。