【摘 要】
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2016年4月,四川双流某黑斑蛙(Rana nigromaculata)养殖场的蝌蚪爆发一种流行性传染病,死亡率近90%,主要临床特征为腹部肿胀,下颌与腹部等体表出血;剖检见腹腔内有淡黄色腹水,肝
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2016年4月,四川双流某黑斑蛙(Rana nigromaculata)养殖场的蝌蚪爆发一种流行性传染病,死亡率近90%,主要临床特征为腹部肿胀,下颌与腹部等体表出血;剖检见腹腔内有淡黄色腹水,肝肿大充血,肠道空虚,腔内充有大量黏液,脾肿大。组织病理学上,患病蝌蚪心、肝、肾、肠与脾等全身多组织器官受损,出现明显的变性与坏死病灶,且在肝细胞与肠上皮等细胞胞浆内发现嗜碱性包涵体。患病蝌蚪组织匀浆液接种鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini cell line,EPC),25℃恒温培养4d,出现明显的CPE,Reed-Muech法测得其滴度为107 TCID50/0.1 mL。用5%浓度的病毒液浸泡8h对健康蝌蚪进行人工感染试验,感染蝌蚪表现出与自然发病蝌蚪相似的症状,死亡率达到80%,证实分离病毒为该病病原。电镜观察发现病毒颗粒为正六边形、有囊膜,对角线直径约135±8nm,在胞质中呈晶格状排列或游离状;主要衣壳蛋白基因(Maior capsid protein,MCP)序列分析表明其与蛙病毒属病毒的相似性在99%以上。综上,判断此次黑斑蛙蝌蚪大量死亡的病原为虹彩病毒科蛙病毒属病毒,将其命名为黑斑蛙蛙病毒(Rana nigromaculata ranavirus,RNRV)。采用常规研究方法,对RNRV的病毒滴度、酸碱敏感性、胰蛋白酶敏感性、有机试剂敏感性、温度敏感性以及病毒最适培养细胞系、最适培养温度、增殖特性等理化特性与表型进行测定。结果显示RNRV具有与蛙病毒属病毒相似的理化特性与表型,其对过酸(pH≤3)、过碱(pH≥10)、有机试剂及胰蛋白酶敏感;60℃作用30min可被灭活;最适培养细胞系为EPC和GCO,最适培养温度范围为25℃-28℃;在25℃条件下感染EPC细胞,12-24h内病毒增殖速度达最大,36h后病毒增殖速度减缓,在72-96 h则进入生长平台期。基于高通量测序技术,采用HiSeq2000测序仪对RNRV进行了全基因组测序。结果显示,该病毒基因组序列全长为104286 bp,包括104个ORFs,其中已知功能的有55个,未知功能的有49个,它们所编码蛋白的氨基酸长度在41-1293AA之间,分子量在4.4-140.8KDa之间,整个基因组GC含量为55.2%,且在基因组序列中的79069-79186bp位置间存在59个CA重复。通过点阵分析发现RNRV基因组与RGV最为相似;以RNRV 26个核心基因编码蛋白的串联氨基酸序列与其他14株虹彩病毒相关序列根据邻近法共同构建系统发育树发现,RNRV归属于蛙病毒属FV3病毒类群,且在进化关系上与分离自中国的RGV、STIV的亲缘关系最近。
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