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研究背景：胃癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其治疗主要依靠手术切除和系统的辅助治疗。系统的辅助治疗，特别是化疗在胃癌的治疗中有举足轻重的地位，成功的化疗可以有效的抑制原发病灶的复燃和远处转移，大大的改善患者的预后，提高患者的远期生存。然而由于肿瘤多药耐药（multidrug resistance MDR）的产生，化疗的效果并不尽人意。因此深入研究胃癌多药耐药产生的机制，是当前胃癌研究的重点之一。此前本课题组以人胃癌细胞株SGC7901、阿霉素的耐药细胞株SGC7901/ADR和丹参逆转后的耐药细胞株为研究对象，应用蛋白质组学技术和高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（HPLC-ESIMS/MS）方法对部分有差异的蛋白进行分析，结果发现S100A6在SGC7901细胞和丹参逆转后的耐药细胞株中呈高表达，而在耐药细胞株SGC7901/ADR中低表达。为验证上述实验结果，其后又应用免疫细胞化学、Western-blot，检测S100A6蛋白在SGC7901和SGC7901/ADR细胞中的表达水平，结果均显示S100A6在SGC7901细胞中高表达，而在SGC7901/ADR中低表达。然而，运用RT-PCR技术检测mRNA水平两种细胞S100A6表达差异时发现：mRNA水平S100A6在以上两种细胞中的表达量无显著性差异。为了进一步研究S100A6与胃癌MDR的关系，课题组构建了S100A6-shRNA真核表达质粒并筛选出最有效的RNA干扰靶点。目的：本实验以人胃癌细胞株SGC7901为研究对象，以RNA干扰技术将干扰效率最高的shRNA-1和shRNA-3质粒并阴性对照NC质粒转染入SGC7901细胞，建立S100A6低表达shRNA质粒稳定转染的SGC7901细胞株，为进一步探讨S100A6与胃癌MDR的关系奠定基础。方法：将干扰效率较高的shRNA-1、shRNA-3质粒和阴性对照NC质粒转化入DH5α感受态大肠杆菌。经选择性LB固体培养基（含卡那霉素）筛选，挑选单菌落，扩增质粒。培养人胃癌细胞株SGC7901，确定G418筛选的最佳浓度。应用脂质体转染法将重组质粒转染到SGC7901细胞中，经压力浓度的G418筛选培养40天，收获稳定传代的转染细胞。将shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞、NC质粒稳转细胞、SGC7901细胞、SGC7901/ADR细胞进行传代培养，分别接种入六孔板，细胞爬片，将爬片用SP法进行免疫细胞化学染色，观察染色情况记录结果。传代培养以上五种细胞，当细胞状态良好并接近汇合时，每种细胞取2瓶提取其细胞总蛋白，测定蛋白浓度。同样方法培养细胞，每种细胞取2瓶提取细胞的总mRNA，测定浓度。然后以western-blot和RT-PCR的方法，分别从蛋白和mRNA水平分析S100A6在这五种细胞中的表达差异。CCK8试验，每种细胞分7组，每组5个复孔，以1×104个/ml细胞密度，100ul/孔，接种96孔板并正常培养24h。按ADR终浓度配制六个梯度的培养液。每种细胞的七组分别加入以上六个梯度浓度的培养液和普通培养液，培养48h，加入CCK810ul/孔，继续培养4h，测定每孔在450nm处的OD值，计算每种细胞的IC50（药物半抑制浓度）、RI（耐药指数）。结果：1.得到了稳定传代的shRNA-1、shRNA-3、NC质粒稳转细胞株。2.免疫细胞化学结果： SGC7901细胞、NC质粒稳转细胞胞浆胞膜深染呈棕褐色-棕黄色，染色强阳性（+++），S100A6呈高表达； shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞及SGC7901/ADR细胞胞浆胞膜染色呈淡黄色，染色弱阳性（+），S100A6呈低表达。3.western-blot结果：S100A6蛋白在SGC7901细胞、NC质粒稳转细胞、SGC7901/ADR细胞、shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞平均表达量为0.97±0.08、0.93±0.07、0.78±0.03、0.68±0.03、0.74±0.05。单因素方差分析做五种细胞的两两比较，SGC7901细胞与SGC7901/ADR细胞、shRNA-1质粒稳转细胞及shRNA-3质粒稳转细胞三种细胞比较，p均小于0.05，差异性显著；SGC7901细胞与NC质粒稳转细胞比较，p大于0.05，差异性不显著。4.RT-PCR结果: S100A6基因mRNA在SGC7901细胞、NC质粒稳转细胞、SGC7901/ADR细胞、shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞中的平均表达量分别为0.975±0.006、0.961±0.034、0.935±0.027、0.768±0.088、0.806±0.055。单因素方差分析做五种细胞两两比较，SGC7901细胞与SGC7901/ADR细胞、NC质粒稳转细胞比较，p值均大于0.05，差异性不显著；SGC7901细胞与shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞比较，p值均小于0.05，差异性显著。5.CCK8试验：ADR作用下SGC7901/ADR细胞、SGC7901细胞、shRNA-1质粒稳转细胞、shRNA-3质粒稳转细胞、NC质粒稳转细胞的IC50分别为1.288±0.168ug/ml、0.336±0.045ug/ml、0.564±0.084ug/ml、0.402±0.001ug/ml、0.342±0.041ug/ml。单因素方差分析做五种细胞的两两比较，SGC7901/ADR细胞与其他四种细胞相比P值均小于0.05，差异性显著。SGC7901细胞与shRNA-1质粒稳转细胞相比P值小于0.05，差异性显著；SGC7901细胞与shRNA-3质粒稳转细胞和NC质粒稳转细胞相比较，P值大于0.05，差异性不显著。结论：1. shRNA-1质粒的靶点序列是本实验干扰效率最高的靶点序列，可以有效的干扰SGC7901细胞中S100A6表达。2.人S100A6基因shRNA真核表达质粒能跟随SGC7901细胞稳定传代，并特异性抑制SGC7901细胞中S100A6mRNA和蛋白的表达，建立了新细胞株。3.通过比较S100A6蛋白在shRNA真核表达质粒稳转细胞、SGC7901细胞、SGC7901/ADR细胞中的差异性表达及以上细胞耐药性的变化表明，S100A6蛋白可能与胃癌MDR的产生有一定关系。