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刺槐(Robinia pseudoacacia)是一种多用途豆科固氮树种(观赏、木材、饲料、蜜源树种),它生长快,材质好,因此已成为人工造林的首选树种。但其有限的耐盐能力却限制着其栽种范围,利用基因工程手段对其耐盐性进行改造是一条重盐碱地区发展刺槐林的重要途径。Na~+在液泡内区隔化的关键因子液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因是植物耐盐基因工程的关键因子,本工作在建立刺槐优良无性系高效再生体系的基础上,利用天然的植物转基因系统—根癌农杆菌介导,在35S启动子驱动下,将来自于苜蓿的抗盐基因MsNHX1导入刺槐离体叶片。同时对刺槐液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因进行了克隆并对其功能进行了初步分析。试验选用的刺槐无性系为84053,利用其嫩茎、叶片和刺槐种子萌发后获得的子叶、下胚轴和幼胚作为外植体,分别研究愈伤组织形成与芽再生能力。嫩茎为外植体时,33.3%外植体产生了不定芽,每个外植体产生不定芽个数为2 - 3个;子叶培养中,40%的外植体形成愈伤组织,形成愈伤组织的速度慢,而且只有50%愈伤分化出1-2个芽;下胚轴培养中,7 d就可以在下胚轴的两端产生大量愈伤并出现芽分化,平均1个外植体分化5个芽,有的可达7 - 8个芽;叶片培养中采用两步法,平均每块分化愈伤块产生的有效嫩梢(大于1.0 cm)数量可达12个,该再生体系能够满足基因转化的需要,可以用于该刺槐无性系的遗传转化。试验对TDZ(Thidiazuron)在刺槐离体叶片再生芽诱导中的作用进行了研究,结果表明在附加2 mg/LTDZ与0.1 mg/L NAA的培养基上芽再生效率最高,平均每块外植体产生15个不定芽,且TDZ浓度越高,产生不定芽的数量越多。但是随着TDZ含量的增加,同时产生过多的愈伤组织,使再生芽不能正常伸长生长,试管苗玻璃化,并抑制芽的伸长生长。通过将再生芽转移到含有少量TDZ 0.05 mg/L,同时添加BA 0.5 mg/L、NAA 0.01 mg/L的培养基上进行继代培养,较好的解决了这一问题。根据分化根的数量和长度确定添加0.5 mg/L IBA的培养基可以最好地诱导刺槐试管苗根的分化。选用离体无菌叶片为外植体对苜蓿NHX1同源基因进行转化,获得了抗性芽。遗传转化过程如下:取新展开的试管苗幼嫩叶片接种于诱导培养基上预培养7d,用携带蓿抗盐基因NH1的农杆菌菌株GV3101浸染叶片