目的:近年来,随着早期筛查策略的广泛应用,宫颈癌的发病率和死亡率均有下降。但宫颈癌仍然是导致女性发病和死亡的主要恶性肿瘤之一,特别是在发展中国家。2020年全球有超过60万的宫颈癌新发病例,超过34万的死亡病例。国家癌症中心2019年发布的全国癌症统计数据显示,我国宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中位居第六位,死亡率在女性恶性肿瘤中位居第八位,且宫颈癌的发病和死亡有“年轻化”的趋势。当宫颈癌发生转移或复发后,患者的5年总生存率仅为17%,严重影响女性的身体健康。因此,探索宫颈癌的发生发展机制,寻求治疗的新靶点仍然很有必要。HPV是一种无包膜环状双链DNA病毒,是最早被确认为可导致癌变的病毒。持续性的高危HPV血清型尤其是HPV16和18型感染是导致宫颈癌的重要危险因素。HPV16导致超过50%的宫颈癌,而HPV16/18导致全球超过70%的宫颈癌。宫颈鳞状细胞癌主要与HPV16有关,而宫颈腺癌主要与HPV18相关。HPV基因组可以编码病毒蛋白,这些蛋白可以参与病毒基因组的复制转录,参与病毒的组装和感染,促进病毒基因组与宿主细胞染色体的整合,在基因组水平、转录组水平和蛋白组水平多途径扰乱宿主细胞的分子调控网络和基因组稳定性,进而导致宿主细胞的恶性转化。特别是高危HPV基因组编码的E6和E7蛋白,在宫颈癌的起始和进展中都发挥了重要作用。因此,当前大部分对宫颈癌的研究都集中在高危HPV感染对宿主细胞的影响上,特别是高危HPV基因组编码的病毒癌蛋白E6/E7和E6/E7下游的分子和通路对宿主细胞的影响上。这些研究不仅使我们更好地认识了病毒扰乱的分子通路,也让宫颈癌的靶向治疗取得了一些突破。宫颈鳞状细胞癌是宫颈癌最常见的病理类型,本研究着重探索HCN2在宫颈鳞状细胞癌中的作用及其上下游调控机制。研究方法:1、利用Kaplan-Meier plotter和GEPIA网站观察HCN2在宫颈癌中的预后信息;利用RT-q PCR检测研究目标HCN2在正常宫颈组织（n=29）和宫颈癌组织（n=113,包括87例的宫颈鳞状细胞癌组织）中的表达水平,并分析其表达水平与宫颈癌临床病理特征之间的关系;通过si RNA干扰的方式,在宫颈鳞状细胞癌细胞系Si Ha和Ca Ski中降低HCN2的表达,并通过Western blot进行干扰效果的验证;通过MTT实验和Ed U实验,检测HCN2干扰对宫颈鳞状细胞癌细胞系增殖能力的影响;通过细胞划痕实验,检测HCN2干扰对宫颈鳞状细胞癌细胞系迁移能力的影响;通过Transwell实验,检测HCN2干扰对宫颈鳞状细胞癌细胞系侵袭能力的影响;通过细胞凋亡实验,检测HCN2干扰对宫颈鳞状细胞癌细胞系凋亡的影响;通过Western blot检测HCN2敲低对宫颈癌抗凋亡和转移相关分子Bcl2和survivin的影响。2、收取si-scramble转染组和si-HCN2转染组的细胞总蛋白,分别与包含Akt、JAK/STAT、MAPK、NFk B和TGF-beta通路的55个靶标的抗体芯片进行杂交反应,筛选出可能受到HCN2调控的蛋白;对筛选出的差异蛋白进行KEGG通路富集分析;对受到影响的关键蛋白和关键通路进行RT-q PCR和Western blot验证。3、在HPV16阳性宫颈鳞状细胞癌细胞系Si Ha和Ca Ski中,干扰HPV16 E6的表达,利用Western blot检测HCN2是否受到HPV16 E6的调控;利用Target Scan Human和ENCORI生物信息学网站预测可能与HCN2 m RNA 3’UTR结合的micro RNA;双荧光素酶报告基因实验验证相关micro RNA与HCN2 m RNA 3’UTR的结合;Western blot验证HPV16 E6下游蛋白和HCN2的相互调控。结果:1、根据Kaplan-Meier plotter和GEPIA网站中的信息,HCN2高表达是宫颈癌的预后不良因素;RT-q PCR结果显示HCN2无论是在宫颈癌组织（n=113）还是仅在宫颈鳞状细胞癌组织（n=87）中的表达水平均显著高于正常宫颈组织（n=29）;MTT实验和Ed U实验显示HCN2干扰抑制宫颈鳞状细胞癌细胞系的增殖能力;细胞划痕实验显示HCN2干扰抑制宫颈鳞状细胞癌细胞系的迁移能力;Transwell实验显示HCN2干扰抑制宫颈鳞状细胞癌细胞系的侵袭能力;细胞凋亡实验显示HCN2干扰促进宫颈鳞状细胞癌细胞系的凋亡;Western blot实验显示HCN2敲低抑制宫颈癌抗凋亡和转移相关分子Bcl2和survivin的表达。2、抗体芯片结果显示,HCN2干扰明显降低了p38的激活,这在Western blot中也再次得到证实;KEGG通路富集分析发现肿瘤中PD-L1表达与PD-1检查点通路可能是HCN2在宫颈鳞状细胞癌细胞系中影响的关键通路;RT-q PCR和Western blot结果显示HCN2敲低可以导致PD-L1在蛋白和RNA水平上均出现下降;Western blot结果显示HCN2敲低可以导致调控PD-L1 m RNA转录的MYC蛋白的下降。3、在HPV16阳性宫颈鳞状细胞癌细胞系Si Ha和Ca Ski中,干扰HPV16 E6的表达,Western blot实验结果显示HCN2的表达也下调;生物信息学网站Target Scan Human和ENCORI均预测HCN2 m RNA 3’UTR存在miR-137-3p的两个结合位点;双荧光素酶实验验证HCN2m RNA 3’UTR可以与miR-137-3p结合;Western blot结果显示HPV16 E6的下游蛋白,同时其m RNA 3’UTR也是miR-137-3p靶点的EZH2的干扰,可以使HCN2的表达下降;在EZH2干扰的基础上,miR-137-3p抑制剂处理可以逆转HCN2的表达;Western blot同样显示,HCN2敲低也可以降低EZH2的表达;在HCN2干扰的基础上,miR-137-3p抑制剂处理同样可以逆转EZH2的表达。结论:1、Kaplan-Meier plotter和GEPIA网站显示,HCN2高表达是宫颈癌的预后不良因素。组织学检测发现HCN2在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达高于正常宫颈组织。HCN2干扰抑制宫颈鳞状细胞癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。2、HCN2在宫颈鳞状细胞癌细胞系中促进p38的激活,并且通过MYC调控PD-L1的表达;3、HCN2通过竞争性内源性RNA途径受到HPV16 E6下游蛋白EZH2的调控;同时HCN2也通过m RNA 3’UTR吸附miR-137-3p来调控EZH2的表达。