研究背景卵巢早衰(Premature Ovarian Failure, POF)是指女性在40岁以前发生的以闭经、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高为特征的一种疾病。目前已知的病因有遗传因素、自身免疫性疾病、医源性损伤如化疗、放疗或手术所致的卵巢血供不良,或特发性原因引起。其中,化疗性卵巢早衰(Chemotherapy-induced Premature Ovarian Failure, CIPOF)是导致POF的一个重要因素。众所周知,化疗药物通过诱导细胞凋亡等多种机制抑制癌细胞增殖,从而改善肿瘤患者预后、延长生存期。但不可置否,化疗药物的细胞毒性尤其是生殖毒性可对卵巢功能产生不良影响。研究表明,约有70-90%接受化疗的女性肿瘤患者出现不同程度的卵巢功能受损。当化疗药物破坏仅成熟卵泡时引起的闭经通常为可逆性,但当原始卵泡被破坏时则会导致持续闭经或卵巢早衰,卵巢功能大多不能恢复。随着女性罹患卵巢恶性肿瘤年轻化的趋势,卵巢功能提前衰退不仅降低了患者的生育能力,同时导致围绝经期综合征提前发生、生活质量下降,进而引起一系列心理及社会问题。目前针对化疗性卵巢早衰的应对措施有药物治疗、冷冻保存胚胎、冷冻卵母细胞、冷冻卵巢组织、卵巢组织移植、干细胞治疗等。其中GnRH类似物主要通过抑制性腺轴从而降低卵巢细胞对化疗药物的敏感性,但因其具有“起爆效应”,即在早期应用时可刺激促性腺激素短暂升高,使卵巢细胞对化疗药物更为敏感,故应在化疗前1-2周使用较好,但这又违背了肿瘤“早发现早治疗”的原则；同时对于罹患激素依赖性恶性肿瘤患者及化疗剂量较高的患者在使用GnRH的安全性及有效性还存在争议。卵巢组织冷冻、卵巢组织移植即干细胞治疗等技术虽具有一定的发展前景,但由于此类技术尚处于实验阶段,其临床疗效、生物伦理及安全性仍需进一步研究。因此,降低卵巢细胞对化疗药物敏感性从而降低化疗药物的细胞毒作用的同时,又不影响化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用,是解决化疗性卵巢衰竭的关键。女性卵巢功能衰退的主要原因是卵泡数量和质量的下降,其中卵巢始基卵泡的库存大小和闭锁程度直接影响雌性哺乳动物的生殖年龄。颗粒细胞作为卵泡内的主要细胞成分,其生长分化是始基卵泡生长启动以及卵泡发育的关键。研究表明静止于Go/Gl期的颗粒细胞及卵泡对化疗药物不敏感,故研究参与调节这一过程的基因对探究卵巢功能的保护具有重要意义。业已证实,化疗药物对卵巢损伤的程度与药物种类、用药剂量等有关：在化疗早期,药物通过对细胞的直接杀伤作用诱导卵母细胞、颗粒细胞及其他支持细胞凋亡,同时可过度激活静止卵泡使原始卵泡过度耗竭；在化疗后期,卵巢由于局部血供障碍、微环境紊乱导致卵泡成熟受阻,卵巢功能衰退。顺铂是一种常见的化疗药物,研究显示其可通过PTEN/AKT通路使原始卵泡过度活化,从而增加卵泡对化疗药物的敏感性,加速早期卵母细胞凋亡,导致大鼠卵巢储备功能下降,进一步导致POF。我们前期研究已表明顺铂对体外培养的卵巢颗粒细胞及大鼠窦前卵泡均具有明显毒性作用。因此如何避免颗粒细胞的过度凋亡及卵泡的提前耗竭是预防化疗药物所致卵巢功能损伤的重要研究方向。Foxo3a作为叉头转录因子FOXO亚家族成员之一,对生物的发育、增殖、衰老和肿瘤的发生发展具有调控作用。研究显示[16,21]Foxo3a既可通过调控Fas/FasL、Bim、Caspases等凋亡相关蛋白表达诱导细胞凋亡,又可通过调控细胞周期蛋白如p27、CyclinD等使细胞周期停滞在Go/G1期。目前关于Foxo3a基因的研究主要用于肿瘤领域,研究显示该基因表达低下或缺失可引起肿瘤细胞增殖能力增强,导致预后不良。但近年来多项研究显示Foxo3a基因可能在哺乳动物卵泡发育中起到关键作用,然而关于其对哺乳动物生殖细胞和卵泡发育调控及卵巢功能的保护作用却众说纷纭。部分学者认为Foxo3a基因对卵巢功能起保护作用,如Castrillon、Schneider和Pelosi等人发现Foxo3a-/-小鼠出现原始卵泡过度耗竭、卵母细胞闭锁和卵泡发育停滞,表现为生育能力减退而；转基因Foxo3a大鼠的卵巢储备功能则明显优于野生型大鼠；孟春花等发现Foxo3a基因可抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡。然而另有部分学者呈反对意见：如Liu.H[16]等发现过表达Foxo3a基因可通过降低BMP-15和Smad蛋白从而抑制小鼠颗粒细胞增殖；隋旭霞等通过体外实验推测Foxo3a及其下游靶基因Bim、FasL、Bax、p27kip1可促进新生大鼠卵母细胞凋亡；Liu.L[15]等通过建立转基因小鼠模型证明卵母细胞内Foxo3a基因持续表达引起卵母细胞及卵泡发育迟缓。哺乳动物的卵泡中存在多种细胞死亡配体-受体系统调控卵巢颗粒细胞的凋亡和卵泡的生长闭锁,其过程非常复杂。研究显示,哺乳动物卵泡发育早期由卵母细胞凋亡启动原始卵泡及初级卵泡闭锁,继而引起颗粒细胞凋亡,而成熟卵泡的闭锁则由颗粒细胞凋亡启动,说明不同时期卵泡闭锁的调控机制可能有所差异。有研究者发现某些蛋白如Smad3在卵巢功能调控中表现出阶段特异性；与此同时,翟立军等研究团队发现部分调控个体发育的基因如miRNA在小鼠不同发育阶段的卵泡及卵泡内颗粒细胞的表达规律不一致,表明同种信号分子在不同阶段卵泡中的颗粒细胞和体内外颗粒细胞的表达可能存在差异。综上所述,是否能够通过调控Foxo3a基因的表达来诱导卵巢颗粒细胞的细胞周期停滞以及促进使窦前卵泡处于相对静止期,从而降低卵巢颗粒细胞及窦前卵泡对化疗药物的敏感性,达到保护卵巢功能、预防化疗性卵巢早衰是本实验的主要研究目的。本实验将利用重组腺病毒介导Foxo3a基因体外感染大鼠原代卵巢颗粒细胞和窦前卵泡,观察该基因对卵巢颗粒细胞和窦前卵泡生长发育的影响和可能的调控机制,并探究其是否可以降低顺铂导致的卵巢毒性作用,进而探究Foxo3a基因防护顺铂损伤卵巢功能的可行性和有效性,为防治卵巢早衰寻找一种新的方法。目的1.克隆大鼠Foxo3a基因并构建大鼠Foxo3a基因腺病毒过表达载体,包装纯化重组腺病毒；体外培养原代大鼠卵巢颗粒细胞,观察不同滴度重组腺病毒体外感染大鼠颗粒细胞的表达情况及表达效率。2.探讨过表达Foxo3a基因对大鼠卵巢颗粒细胞体外发育的影响及调控机制,观察该基因对化疗药物顺铂诱导的卵巢颗粒细胞凋亡是否具有保护作用。3.建立体外分离培养大鼠窦前卵泡系统,观察顺铂对其的毒性作用,并探讨重组腺病毒体外转染大鼠窦前卵泡的可行性及过表达Foxo3a基因对大鼠窦前卵泡体外发育的影响。方法1.重组腺病毒构建：在Genebank中查询大鼠Foxo3a基因序列,合成大鼠Foxo3a cDNA序列,克隆至pUC57载体中；选取经酶切电泳分析及DNA测序鉴定正确的大鼠Foxo3a基因,经过质粒提取、酶切连接反应连接到腺病毒载体质粒pDC315中,构建重组腺病毒载体pDC315-rFoxo3a;通过酶切电泳分析和测序进一步验证目的基因的正确性后,将携带目的基因的重组质粒和骨架质粒共转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装出重组腺病毒AD-rFoxo3a,进行测序验证和滴度测定(TCID50法)。2.体外分离培养大鼠原代卵巢颗粒细胞,利用HE染色及FSHR免疫荧光法进行原代颗粒细胞鉴定,确定重组腺病毒体外感染大鼠卵巢原代颗粒细胞最佳感染复数(MOI),通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测目的基因Foxo3a的表达情况。3.实验分为3组：实验组(重组腺病毒AD-rFoxo3a)、阴性对照组(空载腺病毒rAD)及空白对照组。观察各组细胞生长增殖情况并绘制细胞生长曲线；利用Western-blot法检测各组细胞中cyclinD1、p27、pax、Bim蛋白表达；利用流式细胞术、Hoechst33342/PI染色法分别检测各组细胞的细胞周期及细胞凋亡情况。各组转染48h后加入最适浓度的顺铂,观察各组细胞生长状况,利用流式细胞术检测细胞凋亡情况。4.体外分离培养大鼠窦前卵泡(直径120-150μm),实验分组同前(30个卵泡/组)。利用不同滴度的重组腺病毒体外转染卵泡,观察卵泡生长发育形态及绿色荧光蛋白EGFP和目的蛋白Foxo3a的表达情况；各组转染一定时间后加入最适浓度的顺铂,观察各组卵泡形态学变化及闭锁情况。结果1.本实验构建的携带大鼠Foxo3a基因的质粒经酶切电泳可见约2000bp DNA条带,与Genebank中大鼠Foxo3a基因片段长度(2019bp)一致,经测序鉴定后行同源性分析为99%。重组腺病毒质粒pDC315-rFoxo3a经酶切鉴定及测序证实重组质粒构建成功。重组腺病毒质粒以及骨架质粒共转染293T细胞15d可见病毒空斑,培养21d收毒,经病毒扩增后行琼脂糖电泳鉴定及DNA测序证明重组腺病毒AD-rFoxo3a构建成功,测定滴度为1.106×1010PFU/mL。2.分离培养的大鼠原代卵巢颗粒细胞经鉴定表明细胞纯度及存活率均>90%。当MOI为50时,重组腺病毒对颗粒细胞的感染效率最高,且对细胞无明显毒性。RT-PCR法检测结果发现实验组Foxo3a mRNA表达量明显高于对照组,且在转染后36h表达水平最高；Western-blot法检测结果发现实验组有分子量约80KD蛋白的表达,而对照组中无表达。3.(1)通过绘制生长曲线结果发现,实验组卵巢颗粒细胞生长较对照组受到抑制,而空白对照组及阴性对照组颗粒细胞生长良好,呈现S型生长曲线,两组细胞增值率无明显差异；(2)流式细胞仪检测细胞周期结果显示：实验组细胞在G1期的比例较对照组明显增加,S期细胞所占比例明显减少(P均<0.01)；(3)流式细胞仪检测细胞凋亡及Hoechst33342/PI染色结果发现：实验组细胞凋亡率较对照组增加(P<0.01),而空白对照组及阴性对照组之间细胞凋亡率无明显差异。(4) Western-blot检测相关蛋白结果发现：实验组Bim、p27、CyclinD1蛋白较对照组明显高表达,空白对照组和阴性对照组之间各个蛋白表达无差异；同时,各组均为发现明显Bax蛋白表达；(5)各组细胞加入顺铂24h后行流式细胞仪检测结果发现,实验组卵巢颗粒细胞凋亡率高于空白对照组及实验对照组(P<0.01),后两组细胞凋亡率差异无统计学意义。4.机械法联合酶消化法分离的大鼠窦前卵泡体外培养24h可贴壁,平均培养7d后出现卵母细胞逸出、基底膜破裂等卵泡闭锁表现,在加入顺铂后卵泡闭锁率明显增加。用不同滴度的重组腺病毒体外转染大鼠窦前卵泡结果显示,卵泡内部及基膜表面均未见明显绿色荧光蛋白表达,RT-PCR法未检测Foxo3a的表达。结论1.本实验成功构建了大鼠重组慢病毒AD-rFoxo3a,具有滴度高、体外转染细胞效率高的特点,并能成功感染体外培养的大鼠原代卵巢颗粒细胞,使目的基因Foxo3a在细胞中得以有效转录及表达,为进一步研究该基因的对卵巢颗粒细胞的调控作用及对化疗药物导致的卵巢功能衰退的防治奠定了基础。2.过表达Foxo3a基因在体外可通过促进cyclinD1、p27蛋白表达促使大鼠卵巢颗粒细胞周期停滞在静止期,并可通过促进Bim蛋白表达诱导卵巢颗粒细胞凋亡；同时,本实验未发现过表达Foxo3a基因可以逆转顺铂诱导卵巢颗粒细胞凋亡的作用。3.重组腺病毒对体外培养的大鼠窦前卵泡转染效率极低下,可能因病毒无法通过卵泡表面的基底膜以及体外环境缺少相关因子刺激有关；同时本实验未观察到重组腺病毒AD-rFoxo3a与卵泡共培养对顺铂的卵泡毒性有保护作用。4.关于Foxo3a基因对卵泡发育和闭锁的调控以及卵巢功能的影响还有赖于体内实验进一步明确。