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恶性黑色素瘤是最具侵入性和高度转移性的皮肤癌,其体内自然凋亡率低于其他类型的肿瘤。黑色素瘤仅占所有皮肤癌的5%,但在皮肤癌相关的死亡中,约有80%归因于黑色素瘤,因此对人类健康构成了严重威胁。黑色素瘤的发病率每年都在增加,尽管越来越多的人实现了早发现和早干预,但死于转移性疾病的患者人数仍在继续增加。晚期黑色素瘤的预后很差,中位生存期为6到9个月。在过去的30年中,虽进行了广泛的科学和临床研究,但转移性疾病的治疗选择仍然有限,因此,黑素瘤仍被认为是最难治疗的恶性肿瘤之一。目前,黑色素瘤的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等,手术仍是当前首选治疗方法,但免疫治疗和靶向分子治疗已在转移性黑色素瘤中展现出良好的治疗效果。肿瘤免疫治疗,如免疫检查点阻断、过继免疫、CAR-T、肿瘤疫苗等,在科学实验和临床研究中,已显示出良好的治疗效果。本课题组多年来也一直致力于黑色素瘤瘤苗的探讨和研究,也取得了一定的成果。我们和他人的研究均显示,瘤苗可以通过激活机体的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）效应以及诱导产生特异性抗体而发挥抑制和杀伤肿瘤细胞的作用。但由于肿瘤细胞免疫原性弱,肿瘤的免疫逃逸机制复杂等,瘤苗的实际效应和预期结果有较大的差距。为了提高黑色素瘤瘤苗的免疫效应,筛选有效的靶抗原,包括我们在内的研究者们也一直在不断努力,以期解决这一关键的科学问题。低糖基化的上皮粘蛋白-1（MUC1）在大多数人类上皮癌中过表达,作为肿瘤优势抗原已引起了广泛关注。美国国家癌症研究所执行的一项旨在筛选肿瘤优势抗原的项目,将MUC1列为75种癌症疫苗抗原候选者的第二位,这些都强调了MUC1在其他与肿瘤相关的癌症抗原中,作为肿瘤治疗靶标的潜力。有研究证明,小鼠结肠癌细胞表达的MUC1具有优势抗原表位,能诱发小鼠产生MUC1抗体,同时含有TCR和BCR识别位点,可能是潜在的免疫攻击靶点,可作为疫苗的候选抗原,若对其表达进行调节,将会影响疫苗的免疫原性,进而影响疫苗的抗瘤效应。在正常细胞中,大量的MUC1糖链阻止了抗原肽的提呈,阻碍了CTL的靠近,从而避免了CTL对自体细胞的杀伤。但在肿瘤细胞中,MUC1由于其构型改变而出现新的糖肽抗原表位,其位阻效应就会失去。此外,MUC1 C亚基与β-连环蛋白（β-catenin）联合转运至细胞核,抑制E-cadherin表达,并上调EMT诱导因子Snail,Slug,Vimentin和Twist的表达,从而与肿瘤细胞的转移密切相关。本实验室在结肠癌疫苗研究中发现,肿瘤细胞疫苗的免疫原性与MUC1表达高低显著相关,这些研究结果都证实了MUC1可能是重要的靶抗原,为瘤苗的靶向性提供了新的思路。目的:探讨调节MUC1分子后对黑色素瘤细胞系B16F10生物学特性的影响,制备低表达MUC1的黑色素瘤苗,研究其抗瘤效应并探讨其机制,为验证MUC1作为有效候选靶抗原提供实验依据。方法与内容:1.利用小RNA干扰技术,构建含pHBLV-U6-shMUC1-ZSGreen和pHBLV-U6-shNC-ZSGreen的慢病毒重组载体,分别与辅助质粒psPAX2和PMD2.G及Lipofectamine 2000共转染293T细胞,48小时后收集培养液上清,经孔径为0.45μm的过滤器过滤,后以高速离心法浓缩慢病毒,将包装好的pLV-shMUC1和pLV-shNC病毒感染鼠源黑色素瘤B16F10细胞,然后以极限稀释法筛选出稳定下调MUC1分子的单克隆细胞。采用实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和免疫印迹实验（Western Blot）,在mRNA和蛋白水平上检测MUC1分子的表达。2.探究下调MUC1分子对B16F10细胞若干生物学特性的影响:以CCK8实验、平板克隆实验和细胞周期实验,检测下调MUC1表达后B16F10细胞的增殖情况;以Transwell实验和划痕实验,检测下调MUC1表达后B16F10细胞的迁移能力;以qRT-PCR检测上皮间质转换（EMT）相关分子E-cadherin,N-cadherin和vimentin的mRNAs表达情况。3.分别取1mL浓度为5×10~6/mL的B16F10细胞、Scramble细胞及Lv-shMUC1-B16F10细胞,反复冻融三次,将其制备成肿瘤疫苗后免疫C57BL/6小鼠三次,每次免疫间隔10天,末次免疫后第10天,以1×10~5野生型B16F10细胞于免疫小鼠腹部皮下攻击免疫瘤。实时观察不同免疫鼠生存状态、出瘤时间、肿瘤体积,评价不同组瘤苗抗瘤效果;通过流式细胞仪（FCM）,分析免疫鼠脾细胞杀伤活性和自然杀伤（NK）细胞的杀伤能力;酶联免疫吸附实验（ELISA）检测免疫鼠血清抗MUC1抗体滴度及IFN-γ和TGF-β细胞因子水平;qRT-PCR检测肿瘤组织中相关分子的表达水平。结果:1.以包装好的慢病毒感染B16F10细胞,筛选出稳定感染株后,qRT-PCR和Western Blot检测结果显示:pLv-shMUC1感染B16F10细胞后,MUC1分子表达量显著降低,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。pLv-shNC感染B16F10细胞后,MUC1分子表达量与未感染组无明显差异（P>0.05）。2.体外结果实验显示:与野生型B16F10细胞和Scramble细胞相比,Lv-shMUC1-B16F10细胞克隆形成能力、增殖能力和迁移能力均有所降低;qRT-PCR检测EMT相关分子结果显示:Lv-shMUC1-B16F10细胞中E-cadherin的mRNA表达升高,N-cadherin和vimentin的mRNA表达降低,其差异具有统计学意义（P<0.05）。3.体内瘤苗免疫鼠瘤细胞攻击实验结果显示:与野生型B16F10细胞、Scramble细胞制备的瘤苗相比,Lv-shMUC1-B16F10瘤苗免疫组小鼠抗瘤效果最差,小鼠肿瘤生长最快,肿瘤体积最大,生存期缩短,差异有统计学意义（P<0.05）。FCM分析结果显示,Lv-shMUC1-B16F10瘤苗免疫组的脾细胞杀伤活性及NK细胞杀伤能力最弱;ELISA检测结果显示,Lv-shMUC1-B16F10瘤苗免疫组的anti-MUC1 IgG抗体滴度最低,IFN-γ水平最低,TGF-β水平最高,差异均有统计学意义（P<0.05）;qRT-PCR检测肿瘤组织中EMT相关分子以及颗粒酶和穿孔素mRNA的表达,结果显示,Lv-shMUC1-B16F10瘤苗免疫组E-cadherin的mRNA表达降低,N-cadherin和vimentin的mRNA表达升高,颗粒酶和穿孔素的mRNAs的表达均比B16F10和Scramble瘤苗免疫组的要低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.MUC1分子与黑色素瘤B16F10细胞增殖、迁移、侵袭等能力相关,下调MUC1分子后,上述生物学特性均有所减弱。2.野生型B16F10细胞疫苗和Scramble细胞疫苗能诱导免疫鼠产生较强的抗瘤效应,拮抗黑色素瘤生长,其效应机制与其高表达MUC1抗原诱导较强免疫反应有关。下调MUC1分子后,可影响瘤苗的免疫效应和抗黑色素瘤效应。以上发现表明:MUC1分子可能是B16F10细胞瘤苗的有效候选靶抗原,是B16F10细胞瘤苗较为关键的靶抗原,在黑色素瘤瘤苗的抗瘤效应中发挥重要作用。